高效液相色譜測定飼料中鹽酸氨丙琳的方法
GB/T 8381.11-2005
范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了以高效液相色譜法測定飼料中鹽酸氨丙琳的方法，適用于配合飼料、濃縮飼料、添加劑預(yù)混合飼料和精料補(bǔ)充料中鹽酸氨丙琳的測定，最低檢測濃度為1.0 m g/kg.
原理
飼料樣品中的鹽酸氨丙琳以含有離子對試劑的甲醇溶液超聲提取，離心后過濾，用離子對反相液相色譜法測定。
試荊和材料
除特殊注明外，本法所用的試劑均為分析純，水為蒸餾水，色譜用水符合GB/T 6682一級水的規(guī)定。
4.1 乙睛:色譜純。
4.2 甲醇。
4.3 十二烷基磺酸鈉。
4.4 二乙胺。
4.5 冰乙酸。
4.6 提取液:稱取1. 36 g十二烷基磺酸鈉(4.3),溶于適量2+1(V1+V2)的甲醇水溶液中，并用該混合液稀釋至1 L.
4.7 鹽酸氨丙琳標(biāo)準(zhǔn)品:純度99.8%.
4.8 鹽酸氨丙琳標(biāo)準(zhǔn)溶液
4.8. 1 鹽酸氨丙琳標(biāo)準(zhǔn)儲備液:準(zhǔn)確稱取鹽酸氨丙琳標(biāo)準(zhǔn)品(4. 7)0.0500g，置于100mL容量瓶中，用提取液(4. 6)溶解并定容至刻度，搖勻，其濃度為500ug/mL,貯于4--6℃冰箱中，有效期一個月。
4.8.2 鹽酸氨丙琳標(biāo)準(zhǔn)工作液:準(zhǔn)確吸取鹽酸氨丙琳標(biāo)準(zhǔn)儲備液(4.8.1)10.00 mL，置于50 mL容量瓶中，用提取液(4.6)溶解并定容至刻度，搖勻，其濃度為100 ug/mL。再以此稀釋液配置50 ug/mL,10 ug/mL,5 ug/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。
4.9 HPLC流動相:稱取1.09g 十二烷基磺酸鈉(4.3 )，溶于適量體積分?jǐn)?shù)為30%的乙睛水溶液中，加入3 mL二乙胺(4.4)和10 mL冰乙酸(4.5)，用體積分?jǐn)?shù)為30%的乙睛水溶液稀釋至I L混勻，用0.45mm濾膜過濾，使用前超聲脫氣。
5 儀器
分析天平:感量為0.0001g 和0.001g ，各一臺。
超聲水浴。
離心機(jī):4000r/min-5000r/min,
501高效液相色譜儀:具有紫外檢測器或二極管陣列檢測器。
6 試樣制備
按GB/T 14699.1采取有代表性的樣品200g -500g ，用四分法縮至100g ，粉碎，使全部通過0.45mm孔徑的篩，充分混勻，貯于磨口瓶中備用。
分析步驟
7.1 提取
稱取飼料樣品5g(準(zhǔn)確至0.0 01g )，置于50m L離心管中，準(zhǔn)確加人提取液(4.6)50.00m L，加塞，充分搖動1min，再置超聲水浴中超聲提取20min，其間用手充分搖動兩次。取出后于離心機(jī)上4000r/min離心10min，將上清液用0.45um濾膜過濾，濾液作為試樣溶液。
7.2 測定
7.2 .1 HPLC測定參數(shù)的設(shè)定
色譜柱:C18柱，柱長150mm，柱內(nèi)徑4.6mm,粒度5um，Vertex C18分析柱。
柱溫 : 室溫。
檢測器 :紫外檢測器，檢測波長267nm,
流動相流速:1.5m L/min
進(jìn)樣量 : 10ul-20ul。
7.2.2 定f測定
取 適 量 由7.1獲得的試樣溶液和相應(yīng)濃度的鹽酸氨丙琳標(biāo)準(zhǔn)工作液(4.8.2)進(jìn)行測定，以色譜峰峰
面積做單點校準(zhǔn)定量。
結(jié)果計算與表述
分析結(jié)果表示為鹽酸氨丙琳在飼料中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)X，以毫克每千克(mg/kg)表示，用式(1)計算:X=P2*V1*c*V2/P1*m*V3……………………(1)
式中:
V1— 加人提取液的體積，單位為毫升(mL) ;
V2 鹽酸氨丙琳標(biāo)準(zhǔn)溶液的進(jìn)樣體積，單位為微升(uL);
V3— 試樣溶液的進(jìn)樣體積，單位為微升(uL) ;
P1 鹽酸氨丙琳標(biāo)準(zhǔn)溶液對應(yīng)的色譜峰面積響應(yīng)值;
P2— 試樣溶液對應(yīng)的色譜峰面積響應(yīng)值;
c— 鹽酸氨丙琳標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，單位為微克每毫升(ug/mL);
m— 試樣質(zhì)量，單位為克(g)。
平行測定結(jié)果用算術(shù)平均值表示，保留至小數(shù)點后1位。
9 重復(fù)性
在同一實驗室，由同一操作人員使用同一臺儀器完成的兩個平行測定的相對偏差不大于7%
 
本標(biāo)準(zhǔn)是在查閱了大量國內(nèi)外文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)我國的技術(shù)發(fā)展水平研究制定的。
本標(biāo)準(zhǔn)由國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局提出。
本標(biāo)準(zhǔn)由全國飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。
本標(biāo)準(zhǔn)起草單位:國家飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心(北京)。
本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人:林東下、趙根龍、高生、李蘭、魏秀蓮、范理、蘇曉鷗、靳松。
　　1、流動相的抽作要求：
　　
　　液相級色譜醇，二次蒸餾水，緩沖鹽一定要過濾；
　　
　　流動相脫氣至關(guān)重要（可采用抽濾，超聲波脫氣等方法）
　　
　　2、吸濾頭：
　　
　　特殊情況下可拆下濾頭抽取以判斷其中是否堵塞；亦可用注射器吸取流動相通過吸濾頭打出以判斷其是否堵塞。若有堵塞情況可用異丙醇超聲波清洗；清洗不成功則需要更換。
　　
　　3、單向閥：
　　
　　如遇到泵壓不穩(wěn)或流動相不能抽取，則可能是單向閥出現(xiàn)問題，卸下用異丙醇超聲波清洗，清洗時須按其安裝的方向放置在小燒杯中，切記不可與安裝方向倒置超洗！
　　
　　4、泵頭：
　　
　　泵頭漏液或出現(xiàn)其它故障一般要申請維修（如漏液，或更換柱塞桿及其密封墊等）
　　
　　5、過濾器：
　　
　　當(dāng)色譜峰出現(xiàn)異常情況時，有可能是此部件被污染，拆下用異丙醇超洗或更換過濾墊片。
　　
　　6、排液閥：
　　
　　此處不能完全密封或漏液時一般是其中的墊片污染或磨損，可卸下后取出其墊片用異丙醇超聲波清洗或更換墊圈。
　　
　　7、手動進(jìn)樣器：
　　
　　平時應(yīng)注意用二次蒸餾水和甲醇在裝載狀態(tài)及進(jìn)樣分析狀態(tài)清洗；如出現(xiàn)漏液現(xiàn)象，原因極可能為轉(zhuǎn)子密封墊磨損或污染，一般須申請維修或更換配件。
　　
　　8、流通池：
　　
　　在色譜峰不正常時會可能是此部件補(bǔ)污染?？刹鹦逗笕〕銎渲械膲|片用異丙醇超洗（可根據(jù)說明書進(jìn)行操作或申請維修）。
　　
　　9、工作站：
　　
　　出現(xiàn)死機(jī)可重起計算機(jī)；不正常運(yùn)行時，首先可更換電腦測試其硬件故障；或在本機(jī)上重新插拔接口、重新安裝軟件。

    日常中經(jīng)常會遇到液相色譜儀使用過程中冒出氣泡，一般是由于溫度上升，壓力下降造成的。

    溫度上升或柱溫上升，當(dāng)接近試劑沸點時，試劑汽化產(chǎn)生氣泡，試劑中已含微小氣泡，因加熱變大而產(chǎn)生氣泡。壓力下降產(chǎn)生氣泡，流動相中一直包含微小氣泡，無論超聲過濾，均不能池底去掉它，那么當(dāng)壓力下降時，微小氣泡將長大，且多個小氣泡易聚集成大氣泡，而影響正常實驗。

    氣泡產(chǎn)生原因分析處理：

    1、泵頭：泵頭是壓力變化最劇烈的地方，也是最易產(chǎn)生氣泡的地方，泵頭靠負(fù)壓而吸液，而負(fù)壓必然使流動相中的小氣泡長大，當(dāng)泵腔變正壓時，已長大的氣泡未必能全部變小流入后續(xù)液路，則泵腔內(nèi)將積存氣泡，從而影響吸液精度，鑒于此，泵頭上專門設(shè)計了排氣閥，便于泵頭排氣，觀察柱壓穩(wěn)定了說明泵頭排氣成功。

    2、吸液白管長氣泡。

    a、吸液白管接觸空氣部位漏氣，產(chǎn)生可見氣泡，吸液白管是常壓和負(fù)壓交臂變化部位，其漏表現(xiàn)為大氣進(jìn)入白管內(nèi)，而不易見到管內(nèi)液體漏出。

    處理方法：更換白管。

    b、濾頭堵：濾頭堵使得液體流入濾頭的速度下降，泵強(qiáng)制吸液而產(chǎn)生真空氣泡。

    判斷：拔掉濾頭不再長氣泡則是濾頭堵。

    處理：A、30%硝酸水液超洗濾頭，20分鐘左右。

    B、水超洗濾頭，注意換水多超幾次。

    c、流動相汽化產(chǎn)生氣泡。

    尤其是夏天室溫高，沸點低的試劑易汽化，比如：乙酸，乙mi，氨水，石油醚等易于汽化。

    處理：超聲，降室溫。

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