高效液相色譜法檢測(cè)蜜餞中甜蜜素實(shí)驗(yàn)方法
    一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹　?BR>　　1.檢測(cè)蜜餞中的甜蜜素含量　　
　　2.驗(yàn)證并重現(xiàn)文獻(xiàn)中關(guān)于甜蜜素檢測(cè)的方法，并有針對(duì)性的作出改進(jìn)?！　?BR>　　二、實(shí)驗(yàn)原理　　
　　在酸性的介質(zhì)中，甜蜜素經(jīng)次氯酸鈉溶液衍生，正己烷反相萃取衍生物N,N-二氯環(huán)己胺，在314nm波長(zhǎng)下有最大吸收?！　?BR>　　三、實(shí)驗(yàn)材料、試劑耗材及儀器設(shè)備　　
　　1.實(shí)驗(yàn)材料　　
　　某品牌珍珠梅　　
　　2.試劑耗材　　
　　2.1甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)品乙腈(國(guó)藥色譜純)；超純水(自制)；硫酸(優(yōu)級(jí)純)；次氯酸鈉(有效氯含量超過(guò)5%)；正己烷(色譜純)；針式過(guò)濾器(有機(jī)系和無(wú)機(jī)系)　　
　　2.2工作液　　
　　2.2.1甜蜜素母液：精確稱取1.0000g甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)品，置于100ml容量瓶中加水定容，配制成10.00mg/ml的母液　　
　　2.2.2硫酸溶液(1：1)：取10ml超純水于50ml燒杯中，另量取10ml濃硫酸小心加入到水中，邊加邊攪拌，待溫度降至室溫后使用。　　
　　2.2.3甜蜜素工作液：取甜蜜素母液，分別用水稀釋成0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液?！　?BR>　　3.儀器設(shè)備
      杭州賽析科技STI501液相色譜儀 （配UV501紫外檢測(cè)器）  N2000色譜工作站  DT-230A柱溫箱；N2000色譜工作站（浙大）超純水機(jī)；高速離心機(jī)；超聲波清洗器；漩渦混合器

　　四、實(shí)驗(yàn)方法及步驟　　
　　1.實(shí)驗(yàn)方法　　
　　1.1制作系列梯度的甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)工作曲線　　
　　1.2樣品衍生化，檢測(cè)濃度　　
　　1.3利用高效液相色譜法檢測(cè)甜蜜素含量　　
　　色譜條件如下：　　
　　色譜柱：C18(2),4.6*250mm，5um　　
　　流動(dòng)相：乙腈：水=80：20流速：1ml/min　　
　　進(jìn)樣量：20ul柱溫：40攝氏度　　
　　波長(zhǎng)：314nm　　
　　2.實(shí)驗(yàn)步驟：　　
　　2.1標(biāo)準(zhǔn)工作曲線建立　　
　　2.1.2分別精確吸取10ml甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)工作液至50ml的帶蓋的玻璃瓶中　　
　　2.1.3分別加入2ml硫酸溶液(1：1)，5ml正己烷，1ml次氯酸鈉溶液，旋緊蓋子漩渦震蕩1分鐘　　
　　2.1.4吸取上層的有機(jī)相轉(zhuǎn)移到另一只玻璃瓶中，加入30ml超純水，漩渦震蕩1分鐘　　
　　2.1.5重復(fù)一次水洗過(guò)程，吸取上層有機(jī)相，0.45um濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣檢測(cè)　　
　　2.1.6根據(jù)檢測(cè)數(shù)據(jù)，以樣品濃度為橫坐標(biāo)，檢測(cè)器的響應(yīng)值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線　　
　　2.2樣品測(cè)定　　
　　2.2.1取10g的樣品的果肉，用剪刀將其剪碎，置于100ml的燒杯中，加入50ml超純水，浸泡2小時(shí)，在此期間每隔30分鐘用玻璃棒攪拌一次?！　?BR>　　2.2.2取上清液高速離心或用0.45um的濾膜過(guò)濾　　
　　2.2.3移取10ml離心或過(guò)濾后的溶液按照上述標(biāo)準(zhǔn)品的衍生方法處理，如果樣品中的甜蜜素含量過(guò)高可稀釋至合適的濃度，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)實(shí)際情況將上清液稀釋10倍，　　
　　2.2.4吸取衍生處理后的有機(jī)相層過(guò)濾，取20ul注入液相色譜儀檢測(cè)　　
　　2.2.5根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用外標(biāo)法定量?！　?BR>　　五、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)　　
　　1.甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)品譜圖相關(guān)信息　　
　　1.1標(biāo)準(zhǔn)品譜圖　　
　　1.2甜蜜素系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品疊加圖　　
　　1.3標(biāo)準(zhǔn)工作曲線　　
　　2.樣品譜圖信息　　
　　序號(hào)文件名峰面積保留時(shí)間峰高半高峰寬濃度　　
　　1樣2(稀釋10倍)12327267.3341685212.96755.73546
　　2樣2(稀釋10倍)22249187.3591681712.55853.79997
　　3樣2(稀釋10倍)32237257.4311639212.81553.50424
　　4樣2(稀釋10倍)42281207.3781652112.96554.5937
　　5樣2(稀釋10倍)52242757.3711643712.81253.64058　　
　　6樣2(稀釋10倍)72241997.3861672212.58953.62174　　
　　7最大值2327267.4311685212.96755.735　　
　　8最小值2237257.3341639212.55853.504　　
　　9平均值226327.27.37716623.512.78454.149　　
　　10誤差3511.60.032199.10.1770.87　　
　　11RSD1.55%0.43%1.20%1.39%1.61%　　
　　六、實(shí)驗(yàn)結(jié)論及分析
　　1.根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，此方法的線性工作曲線為：Y=4003.4X 8095.6,線性相關(guān)系數(shù)為：r=0.9999　　
　　2.根據(jù)樣品的譜圖信息，計(jì)算出珍珠梅的甜蜜素含量為：2.8g/kg，超出國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)2.8倍(蜜餞國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)為1.0g/kg)　　
　　七、實(shí)驗(yàn)討論　　
　　1.該實(shí)驗(yàn)未作檢出限、低濃度線性范圍，但作為食品添加劑的甜蜜素來(lái)說(shuō)，該線性范圍及檢出限足夠，如需檢測(cè)更低濃度的甜蜜素含量，該實(shí)驗(yàn)還要進(jìn)一步優(yōu)化?！　?BR>　　2.該實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化過(guò)程中還缺少蜜餞中其他干擾物的影響，但據(jù)有的文獻(xiàn)記載，在此色譜條件下，一些常用的食品添加劑并不影響甜蜜素的檢測(cè)。　　
　　3.樣品在在采集過(guò)程中要注意將其盡量粉碎，以獲得盡量充分的提取，否則測(cè)得的甜蜜素含量偏低　　
　　4.色譜圖中的主峰標(biāo)注雖然是甜蜜素，但實(shí)際上是N,N-二氯環(huán)己胺?！　?BR>　　5.樣品在衍生化的過(guò)程需要特別注意的一點(diǎn)。很多樣品中的成分比較復(fù)雜，在水浸提液中含有很多糖、氨基酸、蛋白質(zhì)和脂類等有機(jī)化合物，這些物質(zhì)在此衍生體系下可能會(huì)凝結(jié)成膠狀物質(zhì)影響甜蜜素衍生的回收率。因此，在這種情況下，我們有兩種解決方法：一是將原浸提也稀釋足夠的倍數(shù)，使能產(chǎn)生膠狀物質(zhì)盡量少，但缺點(diǎn)對(duì)儀器的檢測(cè)限的要求提高，如果采用濃縮精提還要增加前處理的步驟和成本；二是采用在衍生的中間過(guò)程超聲震蕩的方法消除因膠狀物質(zhì)引起的氣泡，排除大部分干擾，有利于下一步的萃取?！　?BR>　　6.需要說(shuō)明的重要一點(diǎn)是，在進(jìn)樣之前一定要用有機(jī)濾膜過(guò)濾樣品溶液，并且在色譜柱之前加上保護(hù)柱，雖然保護(hù)住的加入會(huì)引起峰的擴(kuò)散。如果不未經(jīng)過(guò)濾或?yàn)榧颖Ｗo(hù)柱，色譜柱極易被堵塞并且很難沖洗?！　?BR>　　八、參考文獻(xiàn)　　
　　1.何良興，林賽君，柯春暉，郭柏坤高效液相柱前衍生法測(cè)定蜜餞中的甜蜜素分析檢測(cè)2042009，Vol.30，No.04　　
　　2.甜蜜素試験法日食安監(jiān)発第0829010號(hào)

使用前，要將液相色譜柱進(jìn)行柱的性能測(cè)試，并保存結(jié)果，作為以后評(píng)價(jià)柱性能變化的參考。注意點(diǎn)：1.柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同；2.為了測(cè)得的結(jié)果才有可比性，在做柱性能測(cè)試時(shí)要按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行(出廠測(cè)試所使用的條件是較佳條件)。

關(guān)于液相色譜儀的選擇

    液相色譜儀是一種常見的色譜分析方法，與氣相色譜相比液相色譜可以在常溫中操作，且不受樣品揮發(fā)度和熱穩(wěn)定性的限制。這使得液相色譜非常適合相對(duì)分子量較大，難汽化，不易揮發(fā)或?qū)崦舾械奈镔|(zhì)、離子型化合物和高聚物的分離分析。

    然而要選購(gòu)一臺(tái)品質(zhì)優(yōu)良的液相色譜并不容易。液相色譜儀的指標(biāo)很多，有關(guān)于泵的、關(guān)于檢測(cè)器的、關(guān)于色譜柱的……不過(guò)，從選購(gòu)角度考慮，可以優(yōu)先考慮噪音、漂移、最小檢測(cè)濃度、定性定量重復(fù)性等主要技術(shù)指標(biāo)。當(dāng)然，這些指標(biāo)都要放在系統(tǒng)、回路里去看去比較。

    1.噪音

    噪音指由儀器的電器元件、溫度波動(dòng)、電壓的線性脈沖以及其他非溶質(zhì)作用產(chǎn)生的高頻噪聲和基線的無(wú)規(guī)則波動(dòng)產(chǎn)生的聲音。噪音的大小直接關(guān)系到儀器的檢測(cè)靈敏度，噪音越大檢測(cè)的靈敏度就越低。對(duì)于檢測(cè)低含量的樣品就要求儀器的噪音越小越好，否則噪音過(guò)大將會(huì)導(dǎo)致基線不穩(wěn)，甚至影響分析結(jié)果；

    2.最小檢測(cè)濃度(最小檢測(cè)限)

    最小檢測(cè)濃度是反映儀器靈敏度的重要參數(shù)。根據(jù)公式CL=2×Nd×C/H(CL：最小檢測(cè)濃度 Nd：噪音 C：樣品濃度最小檢測(cè)濃度 H：樣品峰高)，最小檢測(cè)濃度是和噪音成正比的，噪音越大，最小檢測(cè)濃度就越大，靈敏度就越低。如果選購(gòu)的儀器回避了這個(gè)指標(biāo)，說(shuō)明他們不愿在最小檢測(cè)濃度的基礎(chǔ)上去比較噪音；

    3.漂移

    漂移是指儀器穩(wěn)定后一段時(shí)間內(nèi)基線漂離原點(diǎn)的距離，通常用來(lái)衡量?jī)x器穩(wěn)定快慢。高品質(zhì)的儀器能在較短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定，從而在一定程度上提高分析效率；

    4.定性定量重復(fù)性

    主要是考核儀器穩(wěn)定性的指標(biāo)，這對(duì)于分析樣品來(lái)說(shuō)是非常重要的。好的儀器其穩(wěn)定性應(yīng)該是十分不錯(cuò)的，這就要求多次進(jìn)樣保留時(shí)間及含量的一致性，這樣做出來(lái)的結(jié)果才能使人信服。雖然這些指標(biāo)都屬于檢測(cè)器，但是就像前面所說(shuō)的，條件是要放在整個(gè)回路和系統(tǒng)里去看去比較。

    例如：泵的脈動(dòng)會(huì)直接影響噪音指標(biāo)、泵的流量準(zhǔn)確度指標(biāo)，以及密封性不好也會(huì)影響相關(guān)指標(biāo)。所以要系統(tǒng)地看指標(biāo)才可以反應(yīng)出儀器的一些真實(shí)水平。

    在選擇儀器的時(shí)候需要充分考慮到儀器的方方面面才能拿到自己滿意的機(jī)器。

    首先從常規(guī)的幾個(gè)部件做個(gè)簡(jiǎn)單的分析。

    （一）輸液泵應(yīng)具備如下性能：

    ① RSD（流量穩(wěn)定性）<0.3%;

    ② 流量范圍寬， 0.1～5.0ml/min內(nèi)連續(xù)可調(diào)，有的實(shí)驗(yàn)則需要更大流量;

    ③ 輸出壓一般應(yīng)能達(dá)到150~400 kg/cm2,流量越大,最高壓力越低;

    ④ 液缸容積小,有助于減少流動(dòng)相死體積，利于清洗。

    ⑤ 密封性能好，耐腐蝕。

    （二）檢測(cè)器

    ①紫外檢測(cè)器，分為可變單波長(zhǎng)檢測(cè)器VWD和二極管陣列檢測(cè)器DAD，可以檢測(cè)有紫外吸收的物質(zhì)

    ②熒光檢測(cè)器，檢測(cè)有熒光的物質(zhì)

    ③視差折光檢測(cè)器，通用型檢測(cè)器，但對(duì)環(huán)境要求極為苛刻，而且靈敏度低

    ④ELSD，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器

    ⑤MSD，質(zhì)譜檢測(cè)器

    常用的是紫外檢測(cè)，然后是MSD和ELSD

    （三）色譜柱

    要求柱效高、選擇性好，分析速度快等。目前市場(chǎng)上銷售的用于HPLC的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相、有機(jī)聚合物微球(包括離子交換樹脂)、氧化鋁、多孔碳等，其粒度一般為3,5,7,10μm等，柱效理論值可達(dá)5~16萬(wàn)/米。

    一般的分析只需5000塔板數(shù)的柱效;同系物分析500即可;難分離物則可用2萬(wàn)的柱子。

    因此一般10~30cm左右的柱長(zhǎng)基本能滿足復(fù)雜混合物分析的需要。所以要根據(jù)自己實(shí)際情況來(lái)選擇合適的柱子。

    柱效受柱內(nèi)外因素影響，為使色譜柱達(dá)到較佳效率，除柱外死體積要小外，還要有合理的柱結(jié)構(gòu)(盡可能減少填充床以外的死體積)及裝填技術(shù)。即使可以的裝填技術(shù)，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，靠近管壁的部位比較疏松，易產(chǎn)生溝流，流速較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬，這就是管壁效應(yīng)。這種管壁區(qū)大約是從管壁向內(nèi)算起30倍粒徑的厚度。在一般的液相色譜系統(tǒng)中，柱外效應(yīng)對(duì)柱效的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于管壁效應(yīng)。

    此外，溫度在色譜分析中是個(gè)不容忽視的環(huán)境條件，環(huán)境溫度對(duì)溶劑的溶解能力、色譜柱的性能、流動(dòng)相的粘度都有影響。而且不同的檢測(cè)器對(duì)溫度的敏感度不一樣。保持恒定的溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)而言是個(gè)絕對(duì)不容忽視的條件，因此也要留意注溫箱的選擇。以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

    （四）進(jìn)樣器

    進(jìn)樣裝置要求：密封性好，重復(fù)性好，死體積小，保證中心進(jìn)樣，進(jìn)樣時(shí)對(duì)色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響小。而且進(jìn)樣方式多種多樣，可分為隔膜進(jìn)樣、停流進(jìn)樣、閥進(jìn)樣、自動(dòng)進(jìn)樣。自動(dòng)進(jìn)樣器則是市場(chǎng)發(fā)展的趨勢(shì)。

    （五）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)

    一般專業(yè)的液相色譜儀生產(chǎn)廠家都有自己配套的液相色譜儀控制軟件。但有不少液相色譜儀可以使用通用型的色譜數(shù)據(jù)工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算處理。進(jìn)口軟件價(jià)格比較高，這個(gè)自己得根據(jù)資金選擇了。

    二元泵和四元泵的區(qū)別二元有兩個(gè)泵，泵后混合，氣體的溶解度隨壓力的增大而增大，所以二元高壓混合不會(huì)產(chǎn)生氣泡。四元只一個(gè)泵（另外一個(gè)是輔泵），是泵前混合，在常壓下進(jìn)行的，兩種液體混合時(shí)，會(huì)降低氣體在混合溶液中的溶解度，通常會(huì)有氣泡產(chǎn)生，所以四元低壓梯度系統(tǒng)一定要配在線真空脫氣機(jī)