高效液相色譜儀的使用
1．色譜柱它包括空柱和填料?？罩莾?nèi)壁拋光的不銹鋼管，內(nèi)徑為4～5mm，長100～250mm。按氣相色譜法中洗滌空柱的方法洗凈，用勻漿法填充固定相。將此柱裝入儀器的管路中，用柱式機(jī)械往復(fù)泵輸入新鮮脫氣的流動相。等基線平直后可用苯、萘、菲的混合試液，用正己烷（含0.05%甲醇）或甲醇：水（83：17）為流動相測定柱效及分離度塔板數(shù)在2～3萬/ml以上及分離度在1.5以上者，柱效好。為防止柱污染，常用1個50mm長，4~5mm內(nèi)徑，裝有硅膠（40-50mm）或立柱相同填料的保護(hù)柱（預(yù)柱）接在主柱之前，以延長色譜柱的壽命。反相鍵合相柱用畢。必須用水充分流經(jīng)，以洗去鹽類、酸堿等雜質(zhì)防止柱生銹及填料中雜質(zhì)的積聚，再用甲醇流經(jīng)洗滌使色譜柱獲得再生。
2．流動相的洗脫方式配好經(jīng)脫氣的流動相放于貯液瓶中，經(jīng)過有濾過頭、內(nèi)徑2mm的聚四氟乙烯管流入高壓泵進(jìn)入色譜柱，最后自檢測器流出或收集或作廢液回收。用流動相洗脫的方式有恒溶劑脫洗法（isocratic dlution），即自洗脫開始到結(jié)束，溶劑的配比恒定。另一類為梯度洗脫法（gradicnt clution）,即使溶劑的極性強(qiáng)度在色譜過程中逐漸增加。須按一定程序不斷改變流動相的濃度配比，從而使同一個試樣中組分性質(zhì)相差較小的及較大的都能在一次色譜過程中很好分離，而整個色譜過程縮短。必須注意，梯度洗脫法不能用于分子排阻色譜及用電化學(xué)檢測的反相高效液相色譜法中。
3．檢測器適用于血藥濃度的檢測器有紫外線吸收，熒光發(fā)射和電化學(xué)三種。紫外檢測器應(yīng)用于對紫外光有吸收的藥物，大多數(shù)藥物分子對紫外光有吸收，故能較普遍采用，檢測限有0.1μg左右。紫外檢測器有固定波長型、可變波長型及掃描器，既能使流動相停流作組分的定性定量檢測，又能提高測定靈敏度，重現(xiàn)性較好。熒光發(fā)射檢測器對能產(chǎn)生熒光的藥物才能使用。80年代應(yīng)用激光替代氙燈光源，光強(qiáng)度增加了3~4倍，對某些藥物的檢測限可達(dá)pg級。電化學(xué)檢測器是由一個碳糊或破碳做成的蒲層電解池。常用于檢測兒茶酚胺類及有酚類基團(tuán)的各種藥物和代謝物。流出組分進(jìn)入2μl的薄層電解池，在一暄電壓下電解產(chǎn)生電流，放大后檢測，檢測限pg級。
4．?dāng)?shù)據(jù)處理現(xiàn)代高效液相色譜儀帶有數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，除記錄譜外，還能自動記錄峰的保留時間，能自動積分求算峰面積，并能按照預(yù)定的程序作有關(guān)計算，報告分析結(jié)果。
高效液相色譜儀使用過程中常見問題及其解決方法
1 液相色譜儀系統(tǒng)
液相色譜儀主要由貯液瓶、泵、進(jìn)樣器、柱、柱溫箱、檢測器、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成（如圖1所示）。對于整個系統(tǒng)而言，柱子、泵和檢測器是核心部件，同時也是容易出事故的主要場所。
2 常見問題及解決方法
2．1 針對柱壓問題（表1）
柱壓問題是使用高效液相色譜過程中需要密切注意的地方，柱壓的穩(wěn)定與色譜圖峰形的好壞、柱效、分離效果及保留時間等密切相關(guān)。所謂柱壓穩(wěn)定并不是指壓力值穩(wěn)定于一個恒定值，而是指壓力波動范圍在50PSI之間。壓力過高、過低及波動較大都屬于柱壓問題，但柱壓的高低與色譜柱的種類、品牌、液相系統(tǒng)本身及使用的流動相種類相聯(lián)系。值得注意的是在使用梯度洗脫時，進(jìn)柱壓的平穩(wěn)緩慢的變化是允許的。
在實際應(yīng)用中柱壓過高可從以下幾個方面來考慮[1]。首先考慮柱子是否被堵，此時可更換一根新柱子進(jìn)行檢測。
2．2 針對保留時間漂移的問題 [2，3] （表2）
保留時間的改變是很多液相色譜使用者常碰到的問題，其包括了保留時間增大和減小。它的產(chǎn)生與很多原因有關(guān)。
2．3 針對異常色譜峰問題[2-4]
異常的色譜峰指的是色譜圖中無峰或出現(xiàn)負(fù)峰、寬峰、雙峰、肩峰、峰形不對稱等情況。具體情況與原因分析如表3。
3 高效液相色譜儀的保養(yǎng)[5-7]
3．1 HPLC的日常操作條件
工作溫度10～30℃； 相對濕度<80％； 可以是恒溫、恒濕，遠(yuǎn)離高電干擾、高振動設(shè)備。
3．2 泵的保養(yǎng)
使用流動相盡量要清潔；進(jìn)液處的沙芯過濾頭要經(jīng)常清洗；流動相交換時要防止沉淀；避免泵內(nèi)堵塞或有氣泡。
3．3 進(jìn)樣器的保養(yǎng)
每次分析結(jié)束后，要反復(fù)沖洗進(jìn)樣口，防止樣品的交叉污染。
3．4 柱的保養(yǎng)
柱子在任何情況下不能碰撞、彎曲或強(qiáng)烈震動；當(dāng)柱子和色譜儀連接時，閥件或管路一定要清洗干凈；要注意流動相的脫氣；避免使用高粘度的溶劑作為流動相；進(jìn)樣樣品要提純；嚴(yán)格控制進(jìn)樣量；每天分析工作結(jié)束后，要清洗進(jìn)樣閥中殘留的樣品；每天分析測定結(jié)束后，都要用適當(dāng)?shù)娜軇﹣砬逑粗?；若分析柱長期不使用，應(yīng)用適當(dāng)有機(jī)溶劑保存并封閉。
3．5 檢測器(UV)的保養(yǎng)
紫外燈的保養(yǎng)要在分析前、柱平衡得差不多時，打開檢測器；在分析完成后，馬上關(guān)閉檢測器。同時樣品池要保養(yǎng)。
4 結(jié)語
在高效液相色譜使用過程中故障排出時要遵守以下原則：一次只改變一個因素，從而確定假定因素與問題之間的聯(lián)系；如果通過更換組件來排查故障時要注意將拆下的完好組件裝回原位，從而避免浪費；養(yǎng)成良好的記錄習(xí)慣，一個良好的記錄是成功地進(jìn)行故障排除的關(guān)鍵。
總之，在使用高效液相色譜時一定要注意樣品的前處理與儀器的正確操作和保養(yǎng)，儀器系統(tǒng)的干凈是用好儀器和維護(hù)維修儀器的關(guān)鍵。
液相色譜柱的使用維護(hù)
一、液相色譜柱的基本結(jié)構(gòu)。
液相色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺絲（封頭）與柱填料等組成。
柱管：多用不銹鋼制成，若果使用時柱壓不高于70 kg/cm2時，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度。用于柱填料的裝填。
壓帽：即色譜柱兩端套合于柱管端外壁的塑性圓柱帽，中部有小孔，多為聚四氟乙烯制成，用于固定篩板。
密封環(huán)：位于接頭螺旋環(huán)內(nèi)壁的彈性環(huán)，多為聚四氟乙烯制成，用于色譜柱兩端壓帽與柱外壁的密封。
二、色譜柱使用前注意事項。
色譜柱在使用前，hao進(jìn)行柱的性能測試，并將結(jié)果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考。在做柱性能測試時要按照色譜柱出廠報告中的條件進(jìn)行(出廠測試所使用的條件是jia條件)，只有這樣，測得的結(jié)果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同。
1、樣品的前處理
a、hao使用流動相溶解樣品。
b、使用預(yù)處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。
c、使用0.45μm或0.22µm的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。
2、流動相的配制
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點：
a、流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中(或長時間保留在柱中)。
b、流動相與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)
c、流動相的黏度要盡量小，以便得到好的分離效果；降低柱壓降，延長泵的使用壽命(可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度)。
d、流動相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應(yīng)。如使用UV檢測器，hao使用對紫外吸收較低的溶劑配制。
e、流動相沸點不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實驗無法進(jìn)行。
f、在流動相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。
3、流動相流速的選擇
因柱效是柱中流動相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱，要追求jia柱效，hao使用jia流速。對內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml／min，對于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8ml／min為佳。
當(dāng)選用jia流速時，分析時間可能延長?？刹捎酶淖兞鲃酉嗟南礈鞆?qiáng)度的方法以縮短分析時間(如使用反相柱時，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。
注意：
a．含水流動相hao在實驗前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動相不要過夜。hao加入die氮化鈉，防止細(xì)菌生長。
b．流動相要求使用0.45 μm或0.22µm濾膜過濾，除去微粒雜質(zhì)。
c．使用HPLC級溶劑配制流動相，使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命，提高柱性能。
三、 色譜柱的使用及維護(hù)
1、C18等反相色譜柱使用維護(hù)
色譜柱每次使用時一定不要直接使用含無機(jī)鹽的流動相！
A、建議首先使用含有10～30%乙腈或甲醇的高水相（不含鹽）沖洗系統(tǒng)及色譜柱30min以上（如用水-有機(jī)相（90：10～95:5），以0.3～0.6ml/min流速沖洗30min以上），再更換為分析流動相。
B、如果流動相中含有緩沖鹽，請使用過渡流動相過渡后再換分析流動相平衡；
正確使用緩沖鹽，正確使用緩沖鹽的目的是防止緩沖鹽析出，使用緩沖鹽的方法可歸結(jié)為一句話：使用前要過渡，使用后要沖洗。具體方法如下：
注意：過渡流動相是指有機(jī)相和水相比例與分析流動相相同比例，只是不含有緩
沖鹽；
阿奇霉素新柱：建議在正常平衡后增加0.1%磷酸/甲醇（90/10）沖洗17小時
C、注意事項。
C.1除 AQ外（可耐100%純水），其它反相柱應(yīng)避免使用純水相，有機(jī)相比例建議在5%以上。即使AQ也應(yīng)避免長時間使用100%水沖洗。如果一定要用100%水作為流動相，請在酸性條件下使用磷酸鹽緩沖液，這樣能延長色譜柱壽命。
C.2請注意色譜柱的pH、壓力耐受范圍，如超出范圍或變化幅度較大會引起重現(xiàn)性變差、色譜柱提前劣化等問題。
C.3在有機(jī)溶劑含量少、色譜柱溫度高的條件下，耐酸耐堿性能會降低。
C.4使用含有離子對試劑等表面活性劑的流動相，色譜柱的壽命會變短。
C.5請使用與分析柱相同填料的預(yù)柱，否則可能無法得到正常的色譜峰。
C.6.在使用了TFA等強(qiáng)有機(jī)酸或堿(pH>8)的流動相之后，請使用與所選用的流動相組成相同的有機(jī)溶劑和水的混合溶液進(jìn)行置換。若是一周以上的長期保存，請進(jìn)一步使用乙腈進(jìn)行置換，并用附帶的堵頭密封，保存在冷暗處。
C.7通常的沖洗可使用高水相-高有機(jī)相-有機(jī)相（乙腈或甲醇）依次沖洗。在甲醇、乙腈沖洗過程中，重復(fù)注入100～200μl四qi呋喃或異丙醇可有助于去除強(qiáng)疏水性物質(zhì)。
C.8當(dāng)供試品溶液中含有一定量表面活性劑，多次進(jìn)樣后，由于表面活性劑會在篩板及硅膠表面形成表面膜，導(dǎo)致峰變寬、拖尾甚至分叉。此時，處理方法如下：將色譜柱反向連接接(詢問廠家)，不接檢測器，用水-乙腈（90：10～95:5），以0.6ml/min流速沖洗2h以上→再用100%乙腈，以0.6ml/min流速沖洗1h以上→然后正向連接好色譜柱，用水-乙腈（90：10～95:5），以1ml/min流速沖洗1h以上→再用100%乙腈，以1ml/min流速沖洗1h以上
2、SCX 氫型陽離子交換柱。
A、每次使用時請一定避免直接使用含無機(jī)鹽的流動相，避免鹽析?？墒褂酶咚噙^渡后再使用分析流動相。（葡jia胺樣品新柱子，用60%乙腈/40水過渡半小時（正常流速即可），后再直接用葡jia胺流動相平衡即可0.2ml流速平衡過液，沖洗也一樣先用60%乙腈40水，低流速沖半小時，后轉(zhuǎn)到100乙腈）
B、離子交換柱的平衡時間較反相柱更長，請在分析前保證充分的平衡。
C、.離子交換模式中，洗脫行為一般隨以下幾點發(fā)生大幅變化：
①pH ②鹽濃度 ③有機(jī)溶劑量 ④鹽種類
*為了使樣品充分離子化，流動相pHhao與樣品的pKa相差 2.0以上
D、短期保存時，請使用含鹽的水系流動相來保存；長期保存時，請用出廠（或咨詢廠家）流動相純乙腈來保存。注意擰緊柱兩端自帶堵頭，防止溶劑揮發(fā)。
3、NH2色譜柱。
A、每次使用時請注意避免鹽析。
B、弱陰離子交換模式中，一般隨以下幾點洗脫行為發(fā)生大幅變化：
①pH ②鹽濃度 ③有機(jī)溶劑量 ④鹽種類
*為了使樣品充分離子化，流動相pHhao與樣品的pKa相差 2.0以上
C、HILIC模式中，建議使用乙腈作為有機(jī)溶液。乙腈量增加，保留能力增大。
D、糖類的分析
①請設(shè)定乙腈/水的流動相條件。乙腈的濃度越高，則對糖的保留能力越強(qiáng)。
②若采用含甲醇或緩沖鹽的流動相，峰會展寬。
③將其他公司硅膠類NH2色譜柱流動相條件中的乙腈含量增加5vol%，使用我公司NH2柱可重現(xiàn)幾乎相同的色譜圖。
④若將糖的水溶液作為樣品注入，譜峰會展寬。請使用含乙腈50%以上的溶劑來配制糖類樣品。
⑤曾在酸性條件下使用過的色譜柱，糖類分析的保留時間、峰形會發(fā)生變化。
E、離子型物質(zhì)的分析
①請設(shè)定乙腈/磷酸緩沖液且具有一定pH值的流動相條件。
②考察流動相條件時，按照pH由高到低的順序進(jìn)行考察。如果曾經(jīng)在低pH下使用，填料的表面將無法回到初始狀態(tài)。
③有時需要長時間平衡色譜柱(24小時以上)。平衡所需時間與通液量和鹽濃度緊密相關(guān)，因此，時間緊急時請?zhí)岣吡魉?，或pH不變而增加流動相的鹽濃度來進(jìn)行平衡。
④抗壞血酸的色譜峰有時會出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象(樣品氧化)。
F、尿囊素的分析
尿囊素在pH 2～8范圍內(nèi)未離子化，請使用磷酸緩沖液作為流動相進(jìn)行分析。
流動相例：25 mmol/L KH2PO4/ CH3CN = 20 / 80，pH=1.5(H3PO4)
G.一個月以內(nèi)的保存，請使用與所選用流動相組成相同的有機(jī)溶劑和水的混合溶液（不含酸、無機(jī)鹽）進(jìn)行置換，請避免只用水進(jìn)行置換；一個月以上的長期保存，在進(jìn)行了上述處理之后，請用出廠時的溶劑（乙腈）置換并保存
四、 色譜柱的再生
色譜柱經(jīng)過一段時間的使用，會出現(xiàn)柱壓升高，柱效下降，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞；另一種可能是大分子進(jìn)入柱內(nèi)， 使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能是柱頭塌陷，死體積增大。您也可嘗試用下面列舉色譜柱再生的方法處理色譜柱。
A、反相色譜柱的再生：
用以下溶劑至少各30mL沖洗色譜柱(分析柱)
100%甲醇→100%乙腈→75%乙腈+25%異丙醇→100%異丙醇→100%二氯甲烷→100%己烷→100%異丙醇→75%乙腈+25% 異丙醇→100%乙腈
*若使用己烷或二氯甲烷沖洗色譜柱, 則在重新使用反相流動相以前, 必須用異丙醇沖洗色譜柱!!!
一般情況下 ,極性固定相(如 Si , N H2 , Diol 基色譜填料) 的再生可以依次使用 20～30 倍色譜柱體積的正已烷、異丙醇、二氯甲烷、甲醇沖洗色譜柱(因異丙醇的粘度較大 ,沖洗過程中隨時注意調(diào)整沖洗流速) ,然后再以相反的溶劑順序沖洗色譜柱。
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