高 效 液 相 色 譜我國藥典收載高效液相色譜法項目和數(shù)量比較表：方法 項目 數(shù)量
1985年版 1990年版 1995年版 2000年版
HPLC法 鑒別? 9 34 150
檢查? 12 40 160
含量測定 7 60 117 387
鑒于HPLC應(yīng)用在藥品分析中越來越多，因此每一個藥品分析人員應(yīng)該掌握并應(yīng)用HPLC。

I．概論

一、液相色譜理論發(fā)展簡況 色譜法的分離原理是：溶于流動相(mobile phase)中的各組分經(jīng)過固定相時，由于與固定相(stationary phase)發(fā)生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。 色譜法比較早是由俄國植物學(xué)家茨維特（Tswett）在1906年研究用碳酸鈣分離植物色素時發(fā)現(xiàn)的，色譜法(Chromatography)因之得名。后來在此基礎(chǔ)上發(fā)展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法。 液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動相，稱為經(jīng)典液相色譜法，此方法柱效低、時間長（常有幾個小時）。高效液相色譜法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會引起高阻力，需用高壓輸送流動相，故又稱高壓液相色譜法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而稱為高速液相色譜法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也稱現(xiàn)代液相色譜。

二、HPLC的特點和優(yōu)點 HPLC有以下特點： 高壓——壓力可達150~300 Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75 Kg/cm2以上。 高速——流速為0.1~10.0 ml/min。 高效——可達5000塔板每米。在一根柱中同時分離成份可達100種。 高靈敏度——紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。 HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點： 速度快——通常分析一個樣品在15~30 min，有些樣品甚至在5 min內(nèi)即可完成。 分辨率高——可選擇固定相和流動相以達到較佳分離效果。 靈敏度高——紫外檢測器可達0.01ng，熒光和電化學(xué)檢測器可達0.1pg。 柱子可反復(fù)使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。 樣品量少，容易回收——樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。

三、色譜法分類

按兩相的物理狀態(tài)可分為：氣相色譜法(GC)和液相色譜法(LC)。氣相色譜法適用于分離揮發(fā)性化合物。GC根據(jù)固定相不同又可分為氣固色譜法(GSC)和氣液色譜法(GLC)，其中以GLC應(yīng)用廣泛。液相色譜法適用于分離低揮發(fā)性或非揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)。LC同樣可分為液固色譜法(LSC)和液液色譜法(LLC)。此外還有超臨界流體色譜法(SFC)，它以超臨界流體（界于氣體和液體之間的一種物相）為流動相（常用CO2），因其擴散系數(shù)大，能很快達到平衡，故分析時間短，特別適用于手性化合物的拆分。 按原理分為吸附色譜法(AC)、分配色譜法(DC)、離子交換色譜法(IEC)、排阻色譜法(EC，又稱分子篩、凝膠過濾(GFC)、凝膠滲透色譜法(GPC)和親和色譜法。（此外還有電泳。） 按操作形式可分為紙色譜法(PC)、薄層色譜法(TLC)、柱色譜法。

四、色譜分離原理

高效液相色譜法按分離機制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。

1．液固色譜法　

使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據(jù)固定相對組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個吸附－解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5~10μm。適用于分離分子量200~1000的組分，大多數(shù)用于非離子型化合物，離子型化合物易產(chǎn)生拖尾。常用于分離同分異構(gòu)體。

2．液液色譜法　

使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面，或化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的固定相，分離原理是根據(jù)被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離。分離過程是一個分配平衡過程。 涂布式固定相應(yīng)具有良好的惰性；流動相必須預(yù)先用固定相飽和，以減少固定相從擔(dān)體表面流失；溫度的變化和不同批號流動相的區(qū)別常引起柱子的變化；另外在流動相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復(fù)雜化。由于涂布式固定相很難避免固定液流失，現(xiàn)在已很少采用?，F(xiàn)在多采用的是化學(xué)鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。 液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。

正相色譜法　

采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環(huán)已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時間。常用于分離中等極性和極性較強的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。

反相色譜法　

一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調(diào)節(jié)保留時間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用較為廣泛，據(jù)統(tǒng)計，它占整個HPLC應(yīng)用的80%左右。 隨著柱填料的快速發(fā)展，反相色譜法的應(yīng)用范圍逐漸擴大，現(xiàn)已應(yīng)用于某些無機樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5（2~8），太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。有報告新商品柱可在pH 1.5~10范圍操作。

正相色譜法與反相色譜法比較表
正相色譜法? 反相色譜法
固定相極性? 高～中? 中～低
流動相極性 低～中? 中～高
組分洗脫次序 極性小先洗出? 極性大先洗出
從上表可看出，當(dāng)極性為中等時正相色譜法與反相色譜法沒有明顯的界線（如氨基鍵合固定相）。

3．離子交換色譜法　

固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基（稱陽離子交換樹脂）或季氨基（陰離子交換樹脂）。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進行可逆交換，根據(jù)各離子與離子交換基團具有不同的電荷吸引力而分離。 緩沖液常用作離子交換色譜的流動相。被分離組分在離子交換柱中的保留時間除跟組分離子與樹脂上的離子交換基團作用強弱有關(guān)外，它還受流動相的pH值和離子強度影響。pH值可改變化合物的解離程度，進而影響其與固定相的作用。流動相的鹽濃度大，則離子強度高，不利于樣品的解離，導(dǎo)致樣品較快流出。 離子交換色譜法主要用于分析有機酸、氨基酸、多肽及核酸。

4．離子對色譜法　

又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據(jù)被測組分離子與離子對試劑離子形成中性的離子對化合物后，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用于分析離子強度大的酸堿物質(zhì)。 分析堿性物質(zhì)常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外高氯酸、三氟乙酸也可與多種堿性樣品形成很強的離子對。 分析酸性物質(zhì)常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。 離子對色譜法常用ODS柱（即C18），流動相為甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10 mmol/L的離子對試劑，在一定的pH值范圍內(nèi)進行分離。被測組分保時間與離子對性質(zhì)、濃度、流動相組成及其pH值、離子強度有關(guān)。

5．排阻色譜法　

固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動相是可以溶解樣品的溶劑。小分子量的化合物可以進入孔中，滯留時間長；大分子量的化合物不能進入孔中，直接隨流動相流出。它利用分子篩對分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。

?

?

    當(dāng)樣品定量管經(jīng)過充分的沖洗后，可以將旋柄轉(zhuǎn)回取樣位置(Load)，也可以繼續(xù)保持在進樣位置，到下次取樣前才切換回取樣位置。在切換回取樣位置時，將樣品進樣針或微量樣品進樣針從進樣閥中拔出。

    為防止交叉污染，正常情況下不必每次進樣后都沖洗進樣閥注射針導(dǎo)入口。進樣閥內(nèi)根據(jù)專利設(shè)計的直接連接進樣孔，可以使注射針頭的前端直接連接到樣品定量管的末端，沒有其他空間供樣品殘留。這樣在下一次進樣時，就不會有上一次殘留的樣品進入樣品定量管。

    但是在進樣針頭插入或拔出過程中，會有痕量的樣品沉積在針頭密封區(qū)域。精密的測定顯示這種殘留有1nL ~ 10nL。這表明進20μL樣品，會殘留0.005% ~ 0.05%。每次進樣后沖洗注射針導(dǎo)入口可以將此殘留沖洗干凈。沖洗注射針導(dǎo)入口的過程為：設(shè)定流動相的流速為0.1mL/min ~ 1mL/min，將注射針導(dǎo)入口沖洗頭(Rheodyne部件號7125-054)連接到一只體積相對較大的注射器上，用大量的流動相只在進樣位置清洗注射針導(dǎo)入口。這樣進入進樣閥中的液體繞過樣品定量管由樣品溢出管5# 口排出。這一過程可以將注射針導(dǎo)入口、引導(dǎo)管、注射針導(dǎo)入管和注射針密封圈徹底清洗。而采用注射器完全插入式的沖洗方式，則不能全部清洗上述部分的表面。在取樣位置將注射針插入注射針導(dǎo)入口時，針頭推動注射針密封圈內(nèi)少量樣品液體(上一次沖洗注射針導(dǎo)入管留下的)進入樣品定量管。當(dāng)該樣品液體與所用的流動相組成不同，且同時采用部分充滿定量管進樣方式時，在高靈敏度的檢測器上可能出現(xiàn)怪峰。所以沖洗注射針時可以用流動相沖洗。