填料主要以硅膠為基質(zhì)，在其表面鍵合非極性的十八烷基官能團（ODS）稱為C18柱，其它常用的反相柱還有C8,C4,C2和苯基柱等。另外還有離子交換柱，GPC柱，聚合物填料柱等。

一、反相

的選擇

1．柱子的PH值使用范圍

　　反相柱優(yōu)點是固定相穩(wěn)定，應用廣泛，可使用多種溶劑。但

為基質(zhì)的填料，使用時一定要注意

相的PH范圍。一般的C18柱PH值范圍都在2-8，流動相的PH值小于2時，會導致鍵合相的水解；當PH值大于7時硅膠易溶解；經(jīng)常使用緩沖液固定相要降解。一旦發(fā)生上述情況，色譜柱人口處會塌陷。同樣填料各種不同牌號的色譜柱不盡相同。如果流動相PH較高或經(jīng)常使用緩沖液時，建議選擇PH范圍大的柱子，例如戴安公司的Acclaim柱PH 2-9或Zorbax的PH 2-11. 5的柱子。

2．填料的端基封尾（或稱封口）

　　把填料的殘余硅羥基采用封口技術進行端基封尾，可改善對極性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分離；填料穩(wěn)定性好了，組分的保留時間重現(xiàn)性就好。如果待分析的樣品屬酸性或堿性的化合物，可以選用填料經(jīng)端基封尾的色譜柱。

二、液相色譜柱的使用

　　色譜柱在使用前，可以進行柱的性能測試，并將結果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考。在做柱性能測試時要按照色譜柱出廠報告中的條件進行(出廠測試所使用的條件是較佳條件)，只有這樣，測得的結果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同。

1、樣品的前處理

a、可以使用流動相溶解樣品。

b、使用預處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產(chǎn)生不 可逆吸附的雜質(zhì)。

c、使用0.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。

2、流動相的配制

　　液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質(zhì)量交換而達到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點：

a、流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中(或長時間保留在柱中)。

b、流動相與樣品不產(chǎn)生化學反應

c、流動相的黏度要盡量小，以便得到好的分離效果；降低柱壓降，延長泵的使用壽命(可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度)。

d、流動相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應。如使用UV檢測器，可以使用對紫外吸收較低的溶劑配制。

e、流動相沸點不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導致實驗無法進行。

f、在流動相配制好后，一定要進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。

3、流動相流速的選擇

　　因柱效是柱中流動相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱，要追求較佳柱效，可以使用較佳流速。對內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇 1ml／min，對于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8ml／min為佳。

　　當選用較佳流速時，分析時間可能延長。可采用改變流動相的洗滌強度的方法以縮短分析時間(如使用反相柱時，可適當增加甲醇或乙腈的含量)。

注意：

a．含水流動相可以在實驗前配制，尤其是夏天使用緩沖 溶液作為流動相不要過夜?？梢约尤氙B氮化鈉，防止細菌生長。

b．流動相要求使用0.45 μm濾膜過濾，除去微粒雜質(zhì)。

c．使用HPLC 級溶劑配制流動相，使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命，提高柱性能。

三． 色譜柱的維護

1. 色譜柱的平衡

　　反相色譜柱由工廠測試后是保存在乙腈/水中的。新柱應先使用10－20倍柱體積的甲醇或乙腈沖洗色譜柱。請一定確保您分析樣品所使用的流動相和乙腈/水互溶。 每天用足夠的時間以流動相來平衡色譜柱，您就會在處理問題方面獲得最大的”補償”，而且您的色譜柱的壽命也會變得更長！操作步驟：

a. 平衡開始時將流速緩慢地提高，用流動相平衡色譜柱直到獲得穩(wěn)定的基線（緩沖鹽或離子對試劑流速如果較低，則需要較長的時間來平衡）

b. 如果使用的流動相中含有緩沖鹽，應注意用純水”過渡”即每天分析開始前必須先用純水沖洗30分鐘以上再用緩沖鹽流動相平衡； 分析結束后必須先用純水沖洗30分鐘以上除去緩沖鹽之后再用甲醇沖洗30分鐘保護柱子。

2． 色譜柱的再生

　　長期使用的色譜柱，往往柱效會下降（柱子的理論塔板數(shù)減低）?？梢詫ιV柱進行再生，在有條件的實驗室應使用一個廉價的泵進行柱子的再生。　

建議用來沖洗柱子的溶劑體積

色譜柱尺寸 柱體積 所用溶劑的體積

125-4mm 1.6ml 30ml

250-4 mm 3.2ml 60ml

250-10mm 20ml 400ml

選擇再生方法：

極性固定相（如Si，NH2* ，DIOL基色譜填料）的再生：

正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→ 丙酮→乙醇→水**

非極性固定相（如反相色譜填料RP－18，RP－8，CN等）的再生： 水→乙腈→氯仿（或異丙醇）→乙腈→水

注意：

a. 在對NH2改性的色譜柱進行再生時，由于NH2可能以銨根離子的形式存在，因此應該在水洗后用0.1M的氨水沖洗，然后再用水沖洗至堿溶液完全流出。

b. 0.05M稀硫酸可以用來清洗已污染的色譜柱，如果簡單的用有機溶劑/水的處理不能夠完全洗去硅膠表面吸附的雜質(zhì)，在水洗后加用0.05M稀硫酸沖洗非常有效。

3. 色譜柱的維護

a．使用預柱保護分析柱（硅膠在極性流動相/離子性流動相中有一定的溶解度）

b．大多數(shù)反相色譜柱的 pH穩(wěn)定范圍是2－7.5，盡量不超過該色譜柱的pH范圍

c．避免流動相組成及極性的劇烈變化

d．流動相使用前必須經(jīng)脫氣和過濾處理

e．如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動相，應在實驗完畢柱子沖洗干凈，并保存于甲醇或乙腈中

f．氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性，故使用時要注意，柱及連接管內(nèi)不能長時間存留此類溶劑，以避免腐蝕。?