疏水色譜柱是利用樣品分子與固定相的疏水力作用的不同，用流動相洗脫時，各組分遷移速度不同而達到分離的目的。流動相一般為pH 6-8的鹽水溶液，具有對蛋白質的回收率高，蛋白質變性可能性小等優(yōu)勢。由于流動相中不使用有機溶劑，也有利于蛋白質保持固有的活性，其中影響疏水色譜柱實驗效果的影響因素主要有以下四個?
1、鹽類和鹽組成
鹽的摩爾表面張力增大，蛋白質在疏水層析柱內(nèi)的吸附能力相應增大。各種鹽離子和離子對具有破壞周圍水分子有序排列的能力。 流動相中鹽的組成對蛋白質在疏水層析介質上的吸附能力具有為重大的影響。選擇合適的鹽對保證蛋白質的分離以及分離后蛋白質的活性都很重要。硫酸銨、醋酸銨、氯化鈉和磷酸鹽是疏水層析分離常用的幾種鹽。
2、離子強度
離子強度的大小直接影響樣品組分在固定相的保留值。一般增加離子強度來增加組分的保留值，降低離子強度來提高組分的解析附能力。
HIC實驗中，改變離子強度進行洗脫的方式，一般宜采用梯度洗脫法，可提高分離的選擇性。
3、溶液的酸堿度
溶液的pH值主要考慮能維持生物大分子生物活性的pH環(huán)境。一般情況，溶液的pH接近蛋白質的等電點，其疏水性增加，有利于與固定相配基相互作用;遠離其等電點，其疏水性減少，不利于與固定相配基結合，但有利于蛋白質洗脫。因此通過改變?nèi)芤旱膒H也可以改變蛋白質的疏水性。
4、柱溫
一般柱溫升高，生物大分子的構象會發(fā)生變化，疏水作用增加，吸附能力增加，有利于提高層析柱的分離度，所以有時可以通過提高柱溫來增加疏水基團與配基間的相互作用，分離性質相近的化合物，如對分離一些小分子是非常有效的。但是對于具有生物活性的物質或酶類，在高溫條件下易變性失活，因此不宜在高溫條件下進行分離。一般都在常溫或低溫下操作。
449717568