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前言
目前市面上商品化的反相色譜柱各式各樣,時(shí)常讓實(shí)驗(yàn)人員眼花繚亂,產(chǎn)生幸福的煩惱,很難快速選擇合適的色譜柱。通常我們會(huì)從鍵合相類型、鍵合相在硅膠表面的覆蓋率、是否封端、封端類型等方面去選擇反相色譜柱。本文從已表征色譜柱的參數(shù),通過量化數(shù)值去快速選擇合適的反相色譜柱。
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色譜柱表征體系
色譜柱表征體系通過量化分析色譜柱中影響溶質(zhì)保留行為的特征,對(duì)色譜柱進(jìn)行分類,從而指導(dǎo)實(shí)際工作中色譜柱的選擇。有效的色譜柱表征體系應(yīng)具有以下特點(diǎn):
(1)考慮了對(duì)色譜柱選擇性有貢獻(xiàn)的所有因素;(2)每一個(gè)柱參數(shù)表征一種專屬的溶質(zhì)—色譜柱相互作用;(3)能夠得到da部分商業(yè)柱的色譜柱參數(shù);(4)對(duì)于特定色譜柱,不同實(shí)驗(yàn)室能夠得到 可重現(xiàn)的色譜柱參數(shù);(5)在特定實(shí)驗(yàn)條件下測定的色譜柱參數(shù)能應(yīng)用到任何流動(dòng)相或任何柱溫下的分離。
目前國際上比較成熟的色譜柱表征體系有4個(gè),分別是由Snyder、Euerby、Hoogmartens和USP色譜柱工作小組領(lǐng)導(dǎo)完成。其中,由Snyder等基于反相色譜保留機(jī)制提出的疏水消除模型,理論基礎(chǔ)較堅(jiān)實(shí),對(duì)色譜柱選擇性的表征較全面,與其余3個(gè)體系的柱參數(shù)本質(zhì)上并無區(qū)別,均取自代表性溶質(zhì)的保留值,參數(shù)測定方法簡便,實(shí)現(xiàn)選擇相似或者不同色譜柱的目的。由于USP網(wǎng)站公開常用色譜柱的參數(shù),USP方法表征的色譜參數(shù)更方便我們篩選色譜柱。
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色譜柱表征參數(shù)
對(duì)于反相色譜柱選擇性主要為疏水作用、立體選擇性和氫鍵作用,還有一些二級(jí)作用,比如:離子交換、金屬螯合作用等。
3.1 USP數(shù)據(jù)庫
疏水作用(Hy):通過同yi流動(dòng)相體系,在不同的反相色譜柱對(duì)進(jìn)行乙基苯測試,考察乙基苯的保留因子,保留因子越da,色譜柱的疏水作用越強(qiáng)。
立體選擇性(TFA):通過同yi流動(dòng)相體系,在不同的反相色譜柱對(duì)進(jìn)行阿米替林測試,考察阿米替林的拖尾因子,由于阿米替林特殊的立體結(jié)構(gòu),拖尾因子越小,色譜柱的立體選擇性越強(qiáng),同時(shí)硅醇基作用較弱。
金屬雜質(zhì)含量(CTF):色譜柱中會(huì)殘留少量的金屬離子,一般金屬離子會(huì)與喹啉結(jié)構(gòu)發(fā)生螯合作用,導(dǎo)致峰拖尾,故喹啉拖尾因子越da,色譜柱金屬雜質(zhì)含量越da。
氫鍵作用(CFA):阿米替林是堿性化合物,在酸性或中性條件下呈離子態(tài),保留因子較小,保留主要依靠氫鍵作用,阿米替林保留因子越da,色譜柱氫鍵作用越強(qiáng)。
3.2 PQRI數(shù)據(jù)庫
疏水作用(H):通過同yi流流動(dòng)相體系,在不同的反相色譜柱對(duì)進(jìn)行戊基苯和丁基苯測試,考察乙戊基苯和丁基苯的保留因子之比,比值越da,色譜柱對(duì)不同碳鏈長度化合物的選擇性越強(qiáng),疏水作用越強(qiáng)。
立體選擇(S):區(qū)分平面結(jié)構(gòu)(三苯乙烯)和空間體積較da 的結(jié)構(gòu)(鄰三苯基)的能力。前者與后者保留因子之比體現(xiàn)空間選擇性,比值越da,立體選擇越強(qiáng)。圖示見圖1。
氫鍵作用(A或B):通過同yi流動(dòng)相體系,在不同的反相色譜柱測試咖fei因和苯酚保留因子比值,數(shù)值越da,氫鍵作用越強(qiáng)。PQRI數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步將氫鍵能力描述為氫鍵酸度(A)、非電離硅烷與堿相互作用的能力和氫鍵堿度(B)、硅膠表面或鍵合相與酸性分析物的特性進(jìn)一步相互作用的能力。
離子交換作用(pH2.7或7.0):在流動(dòng)相pH2.7和7.0下,分別測試苯芐胺和苯酚保留因子之比,比值越da,說明色譜柱區(qū)分極性化合物的能力越強(qiáng)。
固定相類型:A——A型硅膠,無定型硅膠,表面殘余da 量硅醇基;B——B型硅膠,球形高純硅膠,目前主流硅膠類型,硅醇基殘留少;E——鍵合相含嵌入極性基團(tuán)的固定相;phenyl——聚苯乙烯聚合物固定相;F——氟代固定相。
對(duì)比USP與PQRI的數(shù)據(jù)信息,PQRI數(shù)據(jù)庫的色譜柱參數(shù)更加全面反應(yīng)色譜柱的性能。
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案例
目前色譜柱公司均推出各自方法開發(fā)的推薦色譜柱包,比如Waters公司推出經(jīng)濟(jì)實(shí)惠型的色譜柱包:XBridge C18,XBridge Shield RP18、CORTECS C18+、Xbridge Phenyl和Xselect HSS PFP。通過PQRI數(shù)據(jù)庫檢索。
從上表可知:
①疏水作用CORTECS C18+>XBridge C18>XBridge Shield RP18/Xselect HSS PFP>XBridge Phenyl,XBridge Shield RP18的鍵合相含內(nèi)嵌極性基團(tuán),碳載量相對(duì)低,苯基柱和五氟苯基柱比C18柱碳載量低,故H值較低。
②空間選擇性,Xselect HSS PFP較為突出,CORTECS C18+低,S值反應(yīng)硅膠表面鍵合相的密度。Xselect HSS PFP柱的空間選擇性強(qiáng)。
③氫鍵作用,XBridge Shield RP18和苯基柱突出,XBridge C18低,XBridge Shield RP18內(nèi)嵌的酰胺基團(tuán)和苯基與酸性和堿性分析物均有強(qiáng)偶極作用。這兩根柱子可以分離強(qiáng)極性化合物。
④離子交換作用,在酸性和中性條件下五氟苯基柱的離子交換能力突出,對(duì)苯環(huán)不同取代物的相似物質(zhì)選擇性強(qiáng),CORTECS C18+柱在中性條件下離子交換作用強(qiáng),其對(duì)酸性化合物增強(qiáng)保留,對(duì)堿性化合物有較好的峰型。
這四款反相色譜柱,各具特點(diǎn),在分離不同特點(diǎn)的化合物時(shí)具有各自的特長,在方法開發(fā)中他們可以互補(bǔ),可提高柱篩選的效率。
在實(shí)際工作中,有好多方法有指定的色譜柱,但我們在研究過程中,會(huì)找性能相似的色譜柱作為備選色譜柱??梢酝ㄟ^PQRI數(shù)據(jù)庫查找與目標(biāo)色譜柱相似的色譜柱,只要F值在3以內(nèi),均可嘗試。比如方法中規(guī)定選用Nucleodur C18 Gravity,一個(gè)小眾品牌的色譜柱,如果想替代之,可從數(shù)據(jù)查詢與之類似的色譜柱。
從上可知:與Nucleodur C18 Gravity相似的色譜柱很多,有我們熟悉的Waters Cortecs C18、島津Inertsil ODS-2和Kromasil C18,并且完全替代Nucleodur C18 Gravity使用的概率很高。
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小結(jié)
反相色譜柱表征體系逐漸成熟,并且廣泛地用于篩選色譜柱。根據(jù)da 多待測物質(zhì)性質(zhì)結(jié)合色譜柱參數(shù)可快速篩選目標(biāo)色譜柱。但色譜柱表征體系針對(duì)特定樣品中難分離物質(zhì)對(duì)的分離,還有待細(xì)化。對(duì)于結(jié)構(gòu)類似待測物的分離只和部分關(guān)鍵色譜柱參數(shù)有關(guān)。因此,如何更好地研究難分離物質(zhì)與關(guān)鍵色譜柱參數(shù)的關(guān)系,并針對(duì)品種在液相色譜方法中規(guī)定關(guān)鍵柱參數(shù)的zui佳范圍,還需要研究者的不斷探索。
色譜柱的安裝:
?。?)拆開柱包裝盒,確認(rèn)色譜柱的類型、 尺寸、出廠日期以及柱內(nèi)貯存的溶劑。
?。?)擰下柱兩端接頭的密封堵頭放回包裝盒供備用。
?。?)按柱管上標(biāo)示的流動(dòng)相流向,將色譜柱的入口端通過連接管與進(jìn)樣閥出口相連接(如條件允許,建議在柱前使用保護(hù)柱);柱的出口與檢測器連接。連接管是外徑為1.57mm、內(nèi)徑為0.1-0.3mm的不銹鋼管。連接管的兩端均有空心螺釘及密封用壓環(huán)。在接管時(shí)一定要設(shè)法降低柱外死體積。連接管通過空心螺釘、壓環(huán)后盡量用力插到底,然后順時(shí)針擰緊空心螺釘,直到擰不動(dòng)為止,再用扳手繼續(xù)順時(shí)針擰1/4-1/2圈,切記不要用力過大。如色譜柱通過流動(dòng)相加壓后有漏液現(xiàn)象,請用扳手繼續(xù)順時(shí)針擰1/4圈,直至不漏液為止。
色譜柱的儲(chǔ)存:
1.防止緩沖溶液和水溶液流動(dòng)相產(chǎn)生微生物,做到流動(dòng)相用多少配多少,或在水流動(dòng)相中加200ppm的疊氮鈉以抑制細(xì)菌成長(一定當(dāng)心其毒性和潛在的爆炸性);或在流動(dòng)相中加20%的有機(jī)改性劑,也可抑制微生物生長,有機(jī)改性劑還有助于流動(dòng)相脫氣。
2.盡可能將色譜柱貯存于100%有機(jī)溶劑(乙晴比較好)中,避免在緩沖溶液中保存。
3.使用緩沖溶液后的色譜柱,應(yīng)用15~20倍柱體積的不含緩沖劑的同種水—有機(jī)溶劑流動(dòng)相沖洗色譜柱,后換成100%有機(jī)溶劑儲(chǔ)存。
4.避免用純凈水沖洗鍵合致密的C18柱。
5.將色譜柱的兩端用堵頭擰好,以免柱床填料干裂。
說到混合型液相色譜柱,它是一種能夠發(fā)生多種相互作用模式的色譜柱,作為色譜分離的核心,在目前的液相色譜分析中發(fā)揮著重要的作用?;旌夏J降纳V柱也是種類繁多,有雙重混合模式的,也有三重混合模式的。雙重混合模式包括:反相+陽離子交換,反相+陰離子交換,反相+HILIC等。三重混合模式包括:反相+陽離子交換+陰離子交換,HILIC+陽離子交換+陰離子交換等。
混合模式色譜柱由于其多種優(yōu)點(diǎn),實(shí)驗(yàn)人員在分離復(fù)雜樣品時(shí),越來越多的被使用到實(shí)驗(yàn)中,賽默飛擁有的三重混合模式Trinity系列色譜柱在單次運(yùn)行中可同時(shí)分離離子和疏水性分析物,消除了更換色譜柱,使用離子對(duì)或使用多種色譜填料的需要。
來來來
我們來隆重介紹一下Acclaim Trinity系列色譜柱。Acclaim Trinity系列均為三重混合模式的色譜柱。又分為P和Q兩個(gè)系列,均采用納米微球-硅膠雜化技術(shù),一個(gè)顆粒上集成了三種分離模式。P系列色譜柱可以同時(shí)分離陽離子、陰離子和非極性化合物。Q系列先賣個(gè)關(guān)子~
圖1. 納米微球-硅膠雜化技術(shù)
(點(diǎn)擊查看大圖)
新型Nanopolymer Silica Hybrid(NSH)技術(shù)在對(duì)以下物質(zhì)分離時(shí)可以獲得無可比擬的色譜性能:
01 | 原料藥和反離子 |
02 | 藥物反離子的篩選 |
03 | 酸性和堿性原料藥及各自反離子的混合物 |
04 | 酸性、堿性和中性原料藥的混合物 |
圖2. Trinity P1柱和Trinity P2柱對(duì)比
(點(diǎn)擊查看大圖)
使用與維護(hù)
當(dāng)次使用新的色譜柱時(shí),在進(jìn)行任何進(jìn)樣之前,應(yīng)采用流動(dòng)相進(jìn)行徹底沖洗(例如,在推薦的流速,大約使用 20 柱體積)。
當(dāng)切換到新的流動(dòng)相時(shí), 確保新的流動(dòng)相與色譜柱中以前的流動(dòng)相相容,以避免由于沉淀造成色譜柱堵塞。在進(jìn)行任何進(jìn)樣(例如 20 個(gè)柱體積)之前,應(yīng)完全調(diào)節(jié)色譜柱。
使用色譜柱前,需要把系統(tǒng)里置換為含有鹽的水相和有機(jī)相。保證色譜柱一直在帶有緩沖鹽的體系下使用,是對(duì)色譜柱較好的維護(hù)。
色譜柱清洗
對(duì)于磷酸鹽緩沖液中使用的 3.0 mm 內(nèi)徑色譜柱:
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在 0.3 mL/min 流速時(shí),使用 5 個(gè)柱體積的 20 mM 磷酸鈉(或鉀)緩沖液, pH 值 6 / 乙腈 v/v 50/50 清洗色譜柱。
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在 0.3 mL/min 流速時(shí),使用 20 個(gè)柱體積的 100 mM 磷酸鈉(或鉀)緩沖液, pH 值 6 / 乙腈 v/v 90/10 清洗色譜柱(以強(qiáng)力清除滯留的離子物)。
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在 0.3 mL/min 流速時(shí),使用 5 個(gè)柱體積的 10 mM 磷酸鈉(或鉀)緩沖液, pH 值 6 / 乙腈 v/v 50/50 清洗色譜柱。
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在 0.3 mL/min 流速時(shí),使用 20 個(gè)柱體積的 10 mM 磷酸鈉(或鉀)緩沖液, pH 值 6.4 / 乙腈 v/v 20/80 清洗色譜柱(以強(qiáng)力清除滯留的疏水污染物)。
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使用至少 20 個(gè)柱體積流動(dòng)相平衡色譜柱。
典型應(yīng)用
圖3. Trinity P1柱分析氯酸鹽和高氯酸鹽
圖4.Trinity P1同時(shí)分離藥物反離子
圖5.Trinity P2柱分析藥物相關(guān)陰離子和陽離子