分光光度法是指應(yīng)用分光光度計(jì)的分析方法，具有靈敏、準(zhǔn)確、快速及選擇性好等特點(diǎn)。

    通常所測(cè)樣品溶液濃度下限可達(dá)10-6~10-5mol/L，適用于測(cè)定食品中的微量組分（如肉制品中的亞硫酸鹽、糖果中的二氧化硫等）。

    原理

    物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收

    當(dāng)光束照射到物質(zhì)上時(shí)，光與物質(zhì)發(fā)生相互作用，產(chǎn)生反射、散射、吸收或透射。

    若被照射的是均勻溶液，光的散射可以忽略。

    溶液顏色的產(chǎn)生

    當(dāng)一束白光通過某一有色溶液時(shí)，一些波長(zhǎng)的光被溶液吸收，另一些波長(zhǎng)的光則透過溶液。

    透射光或反射光刺激人眼使人感到顏色的存在。

    人把自身能感覺到的光定義為可見光。

    在可見光區(qū)，不同波長(zhǎng)的光呈現(xiàn)不同的顏色，因此溶液的顏色由透射光的波長(zhǎng)所決定。

    透射光與吸收光可組成白光，故稱這兩種光互為補(bǔ)色光，兩種顏色互為補(bǔ)色。

    光吸收的本質(zhì)

    當(dāng)一束光照射到某物質(zhì)或其溶液時(shí)，組成該物質(zhì)的分子、原子或離子與光子發(fā)生“碰撞”;

    光子的能量就轉(zhuǎn)移到分子、原子或離子上，是這些粒子由最低能態(tài)（基態(tài)）躍遷到較高能太（激發(fā)態(tài)），這個(gè)作用稱為物質(zhì)對(duì)光的吸收。

    被激發(fā)的粒子約在10-8s后回到基態(tài)，并以熱或熒光等形式釋放出能量。

    分子、原子或離子具有不連續(xù)的量子化能級(jí)，僅當(dāng)照射光光子的能量hυ，與被照射物質(zhì)粒子的基態(tài)和激發(fā)態(tài)能量之差相當(dāng)時(shí)，才能發(fā)生吸收。

    不同物質(zhì)微粒由于結(jié)構(gòu)不同而具有不同的量子化能級(jí)，其基態(tài)和激發(fā)態(tài)能量差也不相同。

    所以物質(zhì)對(duì)光的吸收具有選擇性。

    吸收曲線

    吸收曲線，也稱為吸收光譜，描述了物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)的光的吸收能力。

    將不同波長(zhǎng)的光透過某一固定濃度和厚度的有色溶液，測(cè)量每一波長(zhǎng)下有色溶液對(duì)光的吸收程度（即吸光度）；

    然后以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)作圖，繪制的曲線即為吸收曲線。

    不同濃度的同一物質(zhì)，在吸收峰附近的吸光度隨著濃度增加而增大，但最大吸收波長(zhǎng)不變。

    若在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，則靈敏度最高。

    因此，吸收曲線是分光光度法中選擇測(cè)定波長(zhǎng)的重要依據(jù)。

    光吸收基本定律

    即朗伯-比爾定律：

    當(dāng)一束平行單色光通過液層厚度為b的有色溶液時(shí)，溶質(zhì)吸收了光能，光的強(qiáng)度就要減弱。

    溶液的濃度越大，通過的液層厚度越大，入射光越強(qiáng)，則光被吸收的越多，光強(qiáng)度的減弱也越顯著。

    該定律是紫外可見分光光度法等各類吸光光度法定量分析的依據(jù)，是由實(shí)驗(yàn)觀察得到的，不僅適用于溶液，也適用于其他均勻非散射的吸光物質(zhì)。

    A=lg(I/I0)=εbc

    A-吸光度；

    I0-入射光強(qiáng)度，cd；

    I-透射光強(qiáng)度，cd；

    ε-吸光系數(shù)，L/(mol˙cm)；

    b-液層厚度（光程長(zhǎng)度），cm；

    c-有色溶液的濃度，mol/L。

    其物理意義為：

    當(dāng)一束平行單色光通過單一均勻、非散射的吸光物質(zhì)溶液時(shí)，溶液的吸光度與溶液濃度和液層厚度的乘積成正比。

    式中ε是吸光物質(zhì)在特定波長(zhǎng)和溶劑的情況下的一個(gè)特征常數(shù)，數(shù)值上等于濃度為1mol/L的吸光物質(zhì)在1cm光程中的吸光度。

    ε是吸光物質(zhì)吸光能力的量度，ε值越大，方法的靈敏度越高。

    由實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算ε時(shí)，常以被測(cè)物質(zhì)的總濃度代替吸光物質(zhì)的濃度，實(shí)際上時(shí)表觀摩爾吸光系數(shù)。

    在多組分體系中，如果各種吸光物質(zhì)之間沒有相互作用，體系的總吸光度等于各組分吸光度之和，即吸光度具有加和性。

    透光度T是透射光強(qiáng)度I與入射光強(qiáng)度I0之比，即：

    T=I/I0

    因此：A=lg(1/T)

    事實(shí)上，分光光度計(jì)的設(shè)計(jì)原理和工作原理，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化，即儀器有一定的準(zhǔn)確度和精確度。如EppendorfBiophotometer的準(zhǔn)確度≤1.0%(1A)。這樣多次測(cè)試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動(dòng)，都是正常的。另外，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值，離子濃度等：在測(cè)試時(shí)，離子濃度太高，也會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)漂移，因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液，如TE，可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測(cè)試效果。為了最大程度減少顆粒對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值可以在0.1-1.5A。在此范圍內(nèi)，顆粒的干擾相對(duì)較小，結(jié)果穩(wěn)定。從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高(超過光度計(jì)的測(cè)試范圍)。最后是操作因素，如混合要充分，否則吸光值太低，甚至出現(xiàn)負(fù)值;混合液不能存在氣泡，空白液無(wú)懸浮物，否則讀數(shù)漂移劇烈;必須使用相同的比色杯測(cè)試空白液和樣品，否則濃度差異太大;換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致;不能采用窗口磨損的比色杯;樣品的體積必須達(dá)到比色杯要求的最小體積等多個(gè)操作事項(xiàng)。

    除了核酸濃度，分光光度計(jì)同時(shí)顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值，用于評(píng)估樣品的純度，因?yàn)榈鞍椎奈辗迨?80nm。純凈的樣品，比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320檢測(cè)溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A320一般是0。

    蛋白質(zhì)的直接定量(UV法)

    這種方法是在280nm波長(zhǎng)，直接測(cè)試蛋白。選擇Warburg公式，光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應(yīng)的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測(cè)定過程非常簡(jiǎn)單，先測(cè)試空白液，然后直接測(cè)試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì)，一般要消除320nm的“背景”信息，設(shè)定此功能“開”。與測(cè)試核酸類似，要求A280的吸光值至少大于0.1A，較佳的線性范圍在1.0-1.5之間。實(shí)驗(yàn)中選擇Warburg公式顯示樣品濃度時(shí)，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”。這是一個(gè)正常的現(xiàn)象。事實(shí)上，只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超過1%，表明結(jié)果非常穩(wěn)定。漂移的原因是因?yàn)閃arburg公式吸光值換算成濃度，乘以一定的系數(shù)，只要吸光值有少許改變，濃度就會(huì)被放大，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測(cè)試較純凈、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對(duì)于比色法來(lái)說，速度快，操作簡(jiǎn)單;但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾;另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。

    比色法蛋白質(zhì)定量

    蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的混合物，比色法測(cè)定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸(如酪氨酸，絲氨酸)與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān)，從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度。