體積排阻色譜法(SEC)是液相色譜的一種主要分離模式，近年來被廣泛地應(yīng)用在各個(gè)行業(yè)，是研究分子量及分子量分布測試、研究聚合物分子結(jié)構(gòu)，其原理以及方法優(yōu)化的方法你了解嗎?
一、分離原理
尺寸排阻色譜法是按分子尺寸的差異進(jìn)行分離的一種液相色譜方法，也稱凝膠色譜法。排阻色譜的固定相多為凝膠。凝膠是一種由有機(jī)分子制成的分子篩，其表面惰性，含有許多不同大小孔穴或立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。凝膠的孔穴大小與被分離組分大小相當(dāng)，對不同大小的組分分子則可分別滲到凝膠孔內(nèi)的不同深度。尺寸大的組分分子可以滲入到凝膠的大孔內(nèi)，但進(jìn)不了小孔，甚至于完全被排斥，先流出色譜柱。尺寸小的組分分子，大孔小孔都可以滲進(jìn)去，最后流出。因此，大的組分分子在色譜柱中停留時(shí)間較短，很快被洗出。小的組分分子在色譜柱中停留時(shí)間較長。經(jīng)過一定時(shí)間后，各組分按分子大小得到分離。當(dāng)組分X進(jìn)入柱子后，它就要從高濃度的流動(dòng)相向固定相孔隙內(nèi)的流動(dòng)相擴(kuò)散。當(dāng)組分X進(jìn)入色譜固定相達(dá)到擴(kuò)散平衡時(shí)：Xm?Xn組分的分配系數(shù)為：K=【Xs】/【Xm】
尺寸排阻色譜中任何組分的分配系數(shù)應(yīng)符合：0≤K≤1
二、SEC分離色譜條件優(yōu)化
影響SEC色譜分離的主要有以下5個(gè)因素：
1、溫度：一般情況SEC分離是在常溫下進(jìn)行，升高溫度優(yōu)點(diǎn)：1、提高柱效;2、提高分離度;3、降低流動(dòng)相粘度;4、增加樣品的溶解度(聚烯烴、聚酰胺)
2、流速：隨著分子量增大，較優(yōu)流速逐步降低
3、進(jìn)樣體積：一般色譜柱進(jìn)樣體積為柱體積的1%
4、樣品負(fù)載：對于制備蛋白純化，一般情況下10-20mg/ml。
5、流動(dòng)相：聚合物基質(zhì)：一些聚合物基質(zhì)中會(huì)含有少量的羧酸，因次具有一定的負(fù)電性。會(huì)與負(fù)電性的物質(zhì)發(fā)生靜電作用。抑制靜電作用：增加離子強(qiáng)度。
6、硅膠基質(zhì)：硅膠基質(zhì)中殘留和可接近的硅醇基，在一定條件下硅醇基會(huì)發(fā)生解離，當(dāng)pH值增大時(shí)，堿性物質(zhì)會(huì)與硅膠基質(zhì)發(fā)生相互作用，會(huì)增大物質(zhì)的保留。酸性物質(zhì)則由于表面的推動(dòng)作用洗脫會(huì)比預(yù)期更早。調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值。
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