臨床測(cè)定技術(shù)的發(fā)展主要在于方法學(xué)的發(fā)展，而方法學(xué)的發(fā)展依托于試劑生產(chǎn)技術(shù)不斷進(jìn)步更新和型標(biāo)記物的應(yīng)用。分子生物學(xué)正在并最終肯定會(huì)讓對(duì)整個(gè)生命科學(xué)有一個(gè)全面而徹底的認(rèn)識(shí)，其對(duì)免疫測(cè)定技術(shù)發(fā)展的影響也是直接而又有效的，對(duì)以前一些難以檢測(cè)的生物活性物質(zhì)的測(cè)定，并且大大提高了檢測(cè)的靈敏度和特異性。

　　針對(duì)檢測(cè)新型冠狀病毒，中國(guó)計(jì)量院研發(fā)了高靈敏數(shù)字PCR檢測(cè)法和檢測(cè)試劑盒。主要基于數(shù)字PCR系統(tǒng)完成相應(yīng)的引物、探針、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、內(nèi)參基因設(shè)計(jì)及優(yōu)化等工作，為解決“漏檢”問題開辟了新思路。

　　引物

　　在核苷酸聚合作用起始時(shí)，刺激合成的一種具有特定核苷酸序列的大分子，與反應(yīng)物以共價(jià)鍵形式連接，這樣的分子稱為引物。引物通常是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個(gè)引物與靶區(qū)域一端的一條DNA模板鏈互補(bǔ)，另一個(gè)引物與靶區(qū)域另一端的另一條DNA模板鏈互補(bǔ)，其功能是作為核苷酸聚合作用的起始點(diǎn)，核酸聚合酶可由其3端開始合成新的核酸鏈。體外人工設(shè)計(jì)的引物被廣泛用于聚合酶鏈反應(yīng)、測(cè)序和探針合成等。

　　探針

　　一小段單鏈DNA或者RNA片段(大約是20到500bp)，用于檢測(cè)與其互補(bǔ)的核酸序列。雙鏈DNA加熱變性成為單鏈，隨后用放射性同位素(通常用磷-32)、熒光染料或者酶(如辣根過氧化物酶)標(biāo)記成為探針。磷-32通常被摻入組成DNA的四種核苷酸之一的磷酸基團(tuán)中，而熒光染料和酶與核酸序列以共價(jià)鍵相連。當(dāng)將探針與樣品雜交時(shí)，探針和與其互補(bǔ)的核酸(DNA或RNA)序列通過氫鍵緊密相連，隨后，未被雜交的多余探針被洗去。最后，根據(jù)探針的標(biāo)記物種類，可進(jìn)行放射自顯影、熒光發(fā)光、酶聯(lián)化學(xué)發(fā)光等方法來判斷樣品中是否，或者何位置含有被測(cè)序列(即與探針互補(bǔ)的序列)。

　　陰性對(duì)照

　　是針對(duì)“預(yù)期結(jié)果”而說的。凡是肯定出現(xiàn)預(yù)期結(jié)果的組，為陽性對(duì)照組。凡是肯定不會(huì)出現(xiàn)預(yù)期結(jié)果的組，為陰性對(duì)照組。空白對(duì)照(blank control)是針對(duì)“處理因素”而說的。凡是不加處理因素的組，為空白對(duì)照組。所謂不加處理因素，可以是用生理鹽水等溶劑代替所要加的溶液，也可以是給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物開刀但是不摘除某個(gè)器官，等等。陰性對(duì)照和空白對(duì)照不一定能畫等號(hào)。兩者的區(qū)別在于，空白對(duì)照沒加處理因素，陰性對(duì)照加的是別種處理因素。

　　陽性對(duì)照

　　是一種干預(yù)方法，比如一種藥物、療法或醫(yī)療器械，這種干預(yù)方法的有效性以前已經(jīng)是明確的，只是為了說明新療法的有效性。與陰性對(duì)照相比，陽性對(duì)照是與要進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容很相似但不相同，而且其由經(jīng)驗(yàn)可以預(yù)見其結(jié)果，即應(yīng)該得出正面的結(jié)果。

　　數(shù)字PCR系統(tǒng)

　　是一種核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)。當(dāng)前核酸分子的定量有三種方法，光度法基于核酸分子的吸光度來定量;實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real Time PCR)基于Ct值，Ct值就是指可以檢測(cè)到熒光值對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù);數(shù)字PCR是新的定量技術(shù)，基于單分子PCR方法來進(jìn)行計(jì)數(shù)的核酸定量，是一種絕對(duì)定量的方法。主要采用當(dāng)前分析化學(xué)熱門研究領(lǐng)域的微流控或微滴化方法，將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應(yīng)器或微滴中，每個(gè)反應(yīng)器的核酸模板數(shù)少于或者等于1個(gè)。這樣經(jīng)過PCR循環(huán)之后，有一個(gè)核酸分子模板的反應(yīng)器就會(huì)給出熒光信號(hào)，沒有模板的反應(yīng)器就沒有熒光信號(hào)。根據(jù)相對(duì)比例和反應(yīng)器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。

　　基于“單分子模板擴(kuò)增反應(yīng)”計(jì)數(shù)原理，通過芯片式分散體系，在兩萬個(gè)微反應(yīng)器中對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行充分的分隔，通過鑒定陽性及陰性擴(kuò)增結(jié)果比例和專用算法統(tǒng)計(jì)，能以絕對(duì)定量的方式直接鑒定核酸靶分子的含量，具有比普通實(shí)時(shí)定量PCR更好的檢測(cè)靈敏度、擴(kuò)增特異性和定量精確性。

　　該系統(tǒng)適用于極微量核酸的定量檢測(cè)、復(fù)雜樣品中稀有堿基序列的定量檢測(cè)、微小差異核酸拷貝數(shù)精確鑒定等研究領(lǐng)域，可以達(dá)到傳統(tǒng)熒光定量實(shí)時(shí)PCR技術(shù)不能達(dá)到的分辨率和精準(zhǔn)定量的效果。

　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR

　　所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。將標(biāo)記有熒光素的Taqman探針與模板DNA混合后，完成高溫變性，低溫復(fù)性，適溫延伸的熱循環(huán)，并遵守聚合酶鏈反應(yīng)規(guī)律，與模板DNA互補(bǔ)配對(duì)的Taqman探針被切斷，熒光素游離于反應(yīng)體系中，在特定光激發(fā)下發(fā)出熒光，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，被擴(kuò)增的目的基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長(zhǎng)，通過實(shí)時(shí)檢測(cè)與之對(duì)應(yīng)的隨擴(kuò)增而變化熒光信號(hào)強(qiáng)度，求得Ct值，同時(shí)利用數(shù)個(gè)已知模板濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照，即可得出待測(cè)標(biāo)本目的基因的拷貝數(shù)。

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