液相方法開(kāi)發(fā)攻略
彈：實(shí)現(xiàn)保留
今天要為大家?guī)?lái)一個(gè)新干貨系列——液相方法開(kāi)發(fā)攻略！
在進(jìn)行液相色譜分析時(shí)，我們通常有以下訴求：
而在液相分析工作中，液相方法的開(kāi)發(fā)一直是一項(xiàng)比較具有難度的工作，不論是新手小白，還是有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室老師，在面對(duì)新項(xiàng)目的方法開(kāi)發(fā)時(shí)，總會(huì)遇到一些問(wèn)題。
因此，YoYo特意把大曹三耀技術(shù)中心多年來(lái)積累總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)，梳理匯總為這一系列液相方法開(kāi)發(fā)攻略，并將圍繞以下四個(gè)方面展開(kāi)介紹：
★ 實(shí)現(xiàn)保留
★ 實(shí)現(xiàn)分離
★ 峰形和理論塔板數(shù)
★ 壽命
今天先來(lái)介紹重要也是關(guān)鍵的彈——實(shí)現(xiàn)保留，后續(xù)幾篇將在今后陸續(xù)推送，敬請(qǐng)期待喲~
由于大部分化合物都可以在反相分析模式下，使用反相C18色譜柱進(jìn)行分析與保留，因此，在建立新方法時(shí)，反相C18色譜柱也是優(yōu)先選擇的色譜柱。一般可以按照以下步驟進(jìn)行調(diào)整：
反相C18柱初篩 看是否有保留
提問(wèn)：方法初篩時(shí)，選擇什么樣的C18色譜柱比較好？
YoYo老師：選擇一款普適型色譜柱，要求硅膠純度高、金屬雜質(zhì)低、具有適中的疏水性與表面極性，能分析大多數(shù)常規(guī)化合物，峰形好、壽命長(zhǎng)，分離度高，柱效高~
這些要求很過(guò)分嗎？不！
這是我們對(duì)CAPCELL PAK C18 MGII色譜柱的基本要求！
CAPCELL PAK C18 MGII
CAPCELL PAK C18 MG系列色譜柱憑借填料表面致密的聚合物包被技術(shù)，極大程度地抑制了硅膠基材的金屬雜質(zhì)及殘留硅醇基等不良影響，CAPCELL PAK系列色譜柱具有以下特長(zhǎng)：
★ 極大限度地減少配位化合物的吸附
★ 極大限度地抑制殘留硅醇基的二次效應(yīng)
★ 優(yōu)越的耐酸、耐堿性能
★ 能得到對(duì)稱性良好的色譜峰
★ 具備良好的保留與分離能力
其中，CAPCELL PAK C18 MGII色譜柱是普適性很強(qiáng)的C18色譜柱，可以滿足大部分化合物的分析需求。
那么，在經(jīng)過(guò)C18色譜柱初篩之后，還是發(fā)生了保留不充分的情況，應(yīng)該如何調(diào)整分析方法來(lái)實(shí)現(xiàn)保留呢？
1
調(diào)整pH值
在反相模式下，對(duì)于不同性質(zhì)的化合物也應(yīng)采取不同的流動(dòng)相條件及相應(yīng)色譜柱。例如，酸性化合物在酸性條件下保留較強(qiáng)，堿性化合物在堿性條件下保留較強(qiáng)，利用這一性質(zhì)，調(diào)整適合的pH值，并選擇相應(yīng)適合的色譜柱，即可達(dá)到良好保留結(jié)果。
在設(shè)定流動(dòng)相pH時(shí)需要注意：離子性化合物可能會(huì)由于流動(dòng)相pH值設(shè)定的不合理而發(fā)生漂移，建議將流動(dòng)相的pH值設(shè)定在化合物的pKa±2以上范圍。
2
更換保留模式
如果調(diào)整流動(dòng)相pH也不能解決保留問(wèn)題，該化合物可能不適合在反相模式下進(jìn)行保留和分析，這時(shí)，可以考慮更換保留模式進(jìn)行進(jìn)一步的方法摸索。
★ 離子交換模式（離子對(duì)試劑、離子交換柱）
★ HILIC模式
★ 正相模式
色譜柱的選擇
對(duì)于強(qiáng)極性、小分子類化合物，可以使用高極性反相柱或在HILIC模式下進(jìn)行保留嘗試
★ 高極性反相柱：AQ、ADME
★ HILIC（親水性相互作用）柱：PC HILIC、NH2、SILICA
對(duì)于酸性化合物，可以使用陰離子交換柱或反相柱+正離子對(duì)試劑的方法，使酸性化合物處于分子態(tài)，利于增強(qiáng)保留
★ 陰離子交換柱：NH2
★ 反相柱+正離子對(duì)試劑：C18 MG、C18 MGII、SPOLAR C18
對(duì)于堿性化合物和兩性化合物，可以嘗試使用陽(yáng)離子交換柱或反相柱+負(fù)離子對(duì)試劑的方法，使堿性化合物處于分子態(tài)，增強(qiáng)保留
★ 陽(yáng)離子交換柱：SCX、CR
★ 反相柱+負(fù)離子對(duì)試劑：C18 MG、C18 MGII、SPOLAR C18
分離模式選擇例
接下來(lái)，YoYo將以三聚氰胺的分析為例，對(duì)保留困難的化合物的方法建立進(jìn)行說(shuō)明。
三聚氰胺俗稱蜜胺、蛋白精，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，為重要的氮雜環(huán)有機(jī)化工原料，有毒，不可用作食品加工和食品添加劑，pKa=8，屬于弱堿性化合物。
三聚氰胺
Melamine
M.W. :126.12
（一）離子交換模式
在離子交換模式下進(jìn)行分析，能對(duì)三聚氰胺得到良好保留。具體做法可分為以下兩種：
1. 反相色譜柱 + 離子對(duì)試劑
▲CAPCELL PAK C18 MG+離子對(duì)試劑
HPLC Conditions (Refer to GB/T 22388-2008):
Column: CAPCELL PAK C18 MG S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm
M.Phase: 10 mM citric acid, 10mM SOS (pH 3.0 adjusted with NaOH) / CH3CN = 90 / 10
Flow rate: 1 mL/min
Oven Temp.: 40°C
Detector: UV 240 nm
Sample: Melamine in M.P.
Inj. Vol.: 20 μL
2. 離子交換色譜柱分析
▲CAPCELL PAK SCX色譜柱
HPLC Conditions:
Column: CAPCELL PAK SCX UG80 S5; 4.6 mm i.d. × 150 mm
M.Phase: 50 mM KH2PO4 (pH 3.0 adjusted with H3PO4) / CH3CN = 70 / 30
Flow rate: 1 mL/min
Oven Temp.: 30°C
Detector: UV 240 nm
Sample: Melamine in M.P.
Inj. Vol.: 20 μL
CAPCELL PAK SCX
CAPCELL PAK SCX是一款解決了傳統(tǒng)硅膠系離子交換柱存在的問(wèn)題的聚合物包被型強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜柱。在精密分級(jí)的5 μm的高純度硅膠上形成高分子聚合物包被后，導(dǎo)入磺酸基。聚合物包被型的Si-C結(jié)合比一般的化學(xué)結(jié)合型硅膠系SCX的Si-O-Si結(jié)合更穩(wěn)定，耐久性更強(qiáng)。
★ 通過(guò)強(qiáng)陽(yáng)離子交換作用和疏水性相互作用的共同保留機(jī)制來(lái)進(jìn)行保留
★ 批次間重現(xiàn)性良好
★ 耐久性強(qiáng)
不論是反相柱+離子對(duì)試劑，還是使用離子交換色譜柱進(jìn)行分析，都會(huì)發(fā)現(xiàn)色譜柱平衡時(shí)間對(duì)保留時(shí)間的影響。在離子交換模式下進(jìn)行分析時(shí)，需要充分平衡色譜柱，建議小流速過(guò)夜平衡，可以得到比較穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
（二）高極性反相色譜柱
鍵合金剛烷基團(tuán)的CAPCELL PAK ADME色譜柱，兼具高表面極性和一定的疏水性，不僅適用于強(qiáng)極性物質(zhì)的保留，也適用于強(qiáng)極性物質(zhì)和疏水性物質(zhì)的多組分共同分析。
使用鍵合獨(dú)特金剛烷基團(tuán)的CAPCELL PAK ADME色譜柱，在簡(jiǎn)單的2%甲醇條件下即可實(shí)現(xiàn)三聚氰胺和雙氰胺的良好保留與分離。這得益于ADME色譜柱獨(dú)特的表面極性與保留模式。
▲CAPCELL PAK ADME分析三聚氰胺與雙氰胺結(jié)果
*峰1：雙氰胺，峰2：三聚氰胺
HPLC Conditions:
色譜柱：CAPCELL PAK ADME S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm
流動(dòng)相：2% CH3OH
流 速：1000µL / min
溫 度：35°C
檢 測(cè)：PDA210 nm
進(jìn)樣量：5 µL
樣 品：10 μg/mL（流動(dòng)相溶解稀釋）
CAPCELL PAK ADME
CAPCELL PAK ADME色譜柱采用獨(dú)特的立體籠狀金剛烷基官能團(tuán)——ADME官能團(tuán)，突破了以C18官能團(tuán)為主的傳統(tǒng)柱在反相保留機(jī)理中的可分析化合物的限制，使可分析化合物的極性范圍得到了巨大的提升；并且，在極性提升的同時(shí)還兼顧一定的疏水性；從而，包含從強(qiáng)極性化合物到疏水性化合物的復(fù)雜組分樣品在ADME上也能同時(shí)得到良好的保留。
★ 立體籠狀金剛烷基官能團(tuán)——獨(dú)特的獨(dú)特的表面極性與疏水性平衡
★ 高表面極性——對(duì)強(qiáng)極性化合物的良好保留
★ 兼顧一定疏水性——從極性到疏水性化合物的共同分析
★ 立體選擇性——空間異構(gòu)體拆分能力
ADME(adamantane)金剛烷，我們將這種籠狀結(jié)構(gòu)的金剛烷基團(tuán)以控制的鍵合密度導(dǎo)入填料表面，通過(guò)“新型官能團(tuán)”和特有的包被型填料表面“控制技術(shù)”，我們將保持疏水性又提高表面極性變?yōu)榭赡埽挥捎诮饎偼樘赜械幕\狀結(jié)構(gòu)所帶來(lái)的立體選擇性，還賦予了ADME分離結(jié)構(gòu)類似化合物的能力。
（三）親水性相互作用 HILIC模式
親水性相互作用色譜法（HILIC）是針對(duì)在常規(guī)C18色譜柱上保留較弱的強(qiáng)親水性物質(zhì)的保留方法。在HILIC模式下，通過(guò)鍵合極性官能團(tuán)的固定相與反相模式常用的CH3CN / H2O系流動(dòng)相條件相組合，對(duì)親水性化合物進(jìn)行保留與分離。因此，HILIC是在HPLC的分離模式中常使用的反相模式的反相，故也被稱為“反反相模式”。
大阪曹達(dá)獨(dú)立研發(fā)合成了構(gòu)成細(xì)胞膜的主要磷脂類物質(zhì)之一的卵磷脂親水性部位——PC基團(tuán)（磷酸膽堿基團(tuán)），作為PC HILIC色譜柱的官能團(tuán)，對(duì)親水性化合物的保留具有優(yōu)勢(shì)。
如下圖，使用PC HILIC色譜柱和另一款其他品牌色譜柱Column B進(jìn)行對(duì)比，對(duì)三聚氰胺進(jìn)行分析，在10 mmol/L HCOONH4, CH3CN / H2O = 90 / 10（pH = 3.0）條件下，PC HILIC色譜柱所得保留時(shí)間更長(zhǎng)，理論塔板數(shù)更高，即使是在水相比例為20%時(shí)，也得到了足夠的保留。
▲PC HILIC色譜柱在不同條件下分析結(jié)果
HPLC Conditions：
Column : PC HILIC 4.6 mm i.d. x 250 mm
Mobile phase : 10 mmol/L HCOONH4, CH3CN / H2O = 90 / 10, pH = 3.0
Flow rate : 1.0 mL/min
Temperature : 40 ?C
Detection : UV 235 nm
Inj. vol. : 10 μL
Sample dissolved in: Mobile phase
PC HILIC
大阪曹達(dá)獨(dú)立研發(fā)合成了構(gòu)成細(xì)胞膜的主要磷脂類物質(zhì)之一的卵磷脂親水性部位——PC基團(tuán)（磷酸膽堿基團(tuán)），作為PC HILIC色譜柱的官能團(tuán)，對(duì)親水性化合物的保留具有優(yōu)勢(shì)。
★使用超親水性的磷酸膽堿基團(tuán)作為官能團(tuán)的HILIC色譜柱
★隨乙腈含量增加，保留增大，通常70%乙腈
（四）LC-MS分析——混合模式保留
MS檢測(cè)對(duì)流動(dòng)相的要求：
★ 不含離子對(duì)試劑
★ 揮發(fā)性鹽，低濃度
陽(yáng)離子交換填料柱 + 揮發(fā)性鹽溶液（低濃度）
SCX + C18 = CR ！
在以MS檢測(cè)器進(jìn)行分析時(shí)，流動(dòng)相條件會(huì)對(duì)靈敏度產(chǎn)生很大影響，CAPCELL PAK CR色譜柱混合了C18和強(qiáng)陽(yáng)離子交換SCX填料，即使對(duì)多種堿性化合物進(jìn)行同時(shí)分析，也能兼顧對(duì)保留和MS檢測(cè)靈敏度的要求。
如上圖，在中性條件下：
● C18色譜柱：中性化合物得到保留，酸性、堿性化合物快速出峰；
● SCX色譜柱：堿性化合物得到保留，中性、酸性化合物快速出峰；
● 混合了兩種填料的CR色譜柱：堿性化合物得到保留，中性化合物能得到適度保留，酸性化合物依然快速出峰。
此時(shí)，只需將流動(dòng)相條件調(diào)整為酸性，即可在CR色譜柱上同時(shí)保留這三種類型的化合物：
HPLC Conditions：
Column ：CAPCELL PAK CR S5 1:4 ; 2.0 mm i.d. × 150 mm
Mobile Phase：1.0 vol% CH3COOH,
25 mmol/L CH3COONH4 / CH3CN = 50 / 50
Flow rate ：200 µL/min
Temp ：40 ℃
Detection ：UV 240 nm
Injection ：2 µL
Sample ：10 µg/mL
CAPCELL PAK CR
CAPCELL PAK CR色譜柱是一款混合C18和強(qiáng)陽(yáng)離子交換SCX填料的色譜柱。對(duì)多種堿性化合物進(jìn)行同時(shí)分析時(shí)，能同時(shí)兼顧對(duì)保留和MS檢測(cè)靈敏度的要求。
★ 強(qiáng)陽(yáng)離子交換SCX與C18混合填料
★ 具有獨(dú)特分離模式
★ 適合于LC-MS的高靈敏度離子化合物分析
★ 可對(duì)酸性、中性、堿性化合物進(jìn)行同時(shí)保留
★ 有3種混合比例可供選擇
*與武田制藥共同開(kāi)發(fā)
通過(guò)調(diào)整流動(dòng)相的鹽濃度，可在離子交換作用下針對(duì)堿性化合物的保留程度進(jìn)行調(diào)整，從而改變分離模式，達(dá)到不同極性化合物同時(shí)分析的效果。
色譜柱的平衡和使用
反向色譜柱在經(jīng)過(guò)出廠測(cè)試后是保存在甲醇(或乙睛)/水中的。請(qǐng)一定確保您所使用的流動(dòng)相和甲醇（或乙睛）/水互溶。由于色譜柱在運(yùn)輸過(guò)程中可能會(huì)干掉，因此在用流動(dòng)相分析樣品之前，應(yīng)使用10-20倍的體積的甲醇或乙睛平衡色譜柱：如果您所使用的流動(dòng)相中含有緩沖鹽，應(yīng)注意用含水量很高（約95%）的流動(dòng)相過(guò)渡，樣品分析完后，沖洗柱子是亦然。過(guò)去傳統(tǒng)的方法使用純水沖洗，對(duì)于非極性柱，如C8或C18，由于純水不能浸潤(rùn)填料表面而沖倒碳鏈，造成柱效下降。另外，分析樣品時(shí)，由于純水在填料表面不能浸潤(rùn)形成水膜，出現(xiàn)樣品不保留而分不開(kāi)，重現(xiàn)性差，所以對(duì)一般的C18和C8，有機(jī)溶劑不能低于5%。硅膠柱或極性色譜柱在經(jīng)過(guò)出廠測(cè)試后是保存在正庚烷中的。如果該色譜柱需要使用含水或甲醇或乙睛的流動(dòng)相，請(qǐng)?jiān)谑褂昧鲃?dòng)相之前用乙醇或異丙醇平衡。
平衡過(guò)程中，將流速緩慢地提高用流動(dòng)相平衡色譜柱直到獲得穩(wěn)定的基線（緩沖鹽或離子對(duì)試劑濃度如果較低，則需要較長(zhǎng)的時(shí)間平衡）
色譜柱的再生
建議用來(lái)沖洗的溶劑體積
?
| ?色譜柱規(guī)格 | 柱體積? | 溶劑體積? |
| ?150*4.6 | 2.50ml? | 50ml |
| ?250*4.6 | ?5.0ml | 100ml |
| ?250*10 | ?20ml | 400ml? |
?
請(qǐng)根據(jù)下表選擇您的再生方法：
極性固定相（如Si,NH2,Diol色譜填料）的再生：正庚烷-氯仿-乙酸乙酯-丙酮-乙醇-水
非極性固定相（如反向填料C18,C8等）的再生：水-乙睛-氯仿（或異丙醇）-乙睛-水
0.05M稀硫酸可以用來(lái)清洗已污染的色譜柱
色譜柱的維護(hù)：
? 1、使用保護(hù)柱
? 2、大多數(shù)柱的PH穩(wěn)定范圍是2-7.5，盡可能在此范圍內(nèi)使用
? 3、避免流動(dòng)相組成及極性有劇烈變化
? 4、流動(dòng)相使用前必須經(jīng)脫氣和過(guò)濾處理
? 5、如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動(dòng)相，要在實(shí)驗(yàn)完畢將柱子沖洗干凈
? 6、壓力升高時(shí)更換保護(hù)柱
?
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等離子清洗機(jī),反應(yīng)釜,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,高精度溫濕度計(jì),露點(diǎn)儀,高效液相色譜儀價(jià)格,霉菌試驗(yàn)箱,跌落試驗(yàn)臺(tái),離子色譜儀價(jià)格,噪聲計(jì),高壓滅菌器,集菌儀,接地電阻測(cè)試儀型號(hào),柱溫箱,旋渦混合儀,電熱套,場(chǎng)強(qiáng)儀萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)價(jià)格,洗瓶機(jī),勻漿機(jī),耐候試驗(yàn)箱,熔融指數(shù)儀,透射電子顯微鏡。
高效液相色譜儀是進(jìn)行定量分析，雜質(zhì)檢查等分析工作中主要的精密儀器，色譜柱是液相色譜儀的zui核心部件。
在這里，介紹一下色譜柱使用中的注意事項(xiàng)及使用心得。
1、柱頭類型和不銹鋼毛細(xì)管接頭的匹配
色譜柱是消耗品，不是儀器原配的情況很多，如果接頭和柱頭深度匹配將會(huì)產(chǎn)生漏液或者死體積過(guò)大的現(xiàn)象。
接頭比柱頭深度長(zhǎng)，不易擰緊而漏液；接頭比柱頭深度短，柱頭內(nèi)留有空隙而產(chǎn)生死體積，使譜帶展寬和峰拖尾。
2、溶劑的匹配轉(zhuǎn)換
色譜柱內(nèi)保存溶劑和儀器系統(tǒng)內(nèi)存留溶劑，如果和流動(dòng)相不匹配，使用前需進(jìn)行轉(zhuǎn)換。
特別是流動(dòng)村j含緩沖鹽時(shí)，如保存溶劑足純有機(jī)相或有機(jī)相比例高，直接將新柱接人使用，會(huì)導(dǎo)致緩沖鹽在柱內(nèi)結(jié)晶析出，造成柱頭堵塞。建議儀器和色譜柱經(jīng)常使用，用10％的有機(jī)溶劑保持即可。
3、流動(dòng)相及待測(cè)樣品的過(guò)濾
日常分析工作中，我們使用的流動(dòng)栩和待測(cè)樣品應(yīng)用0．45pm濾膜過(guò)濾后再連接或注入到色譜儀上。
對(duì)于有機(jī)相比例高的流動(dòng)栩可以一起過(guò)濾出來(lái)備用，但是有機(jī)相比例小的流動(dòng)相一定要現(xiàn)用現(xiàn)濾，分析結(jié)束時(shí)一定要先用10％的有機(jī)溶劑沖洗管路及色譜柱，為有機(jī)相少的流動(dòng)相容易滋生細(xì)菌，造成色譜柱堵寒，影響色譜柱性能。
4、色譜柱分析時(shí)應(yīng)進(jìn)行平衡和老化
進(jìn)行的方法是運(yùn)行幾次完整的分析程序(包括進(jìn)樣)，直到觀察到峰形、保留時(shí)間和峰面積穩(wěn)定為止。對(duì)某些特定的待測(cè)物，如分子量大于1000的，閃擴(kuò)散速度慢，老化時(shí)間相應(yīng)要長(zhǎng)，可采取大濃度進(jìn)樣或在同一個(gè)洗脫周期內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣多針的方式加快老化。
5、pH使用范圍
一般認(rèn)為硅膠基質(zhì)柱子的pH使用范足2-8，如果選用的是高品質(zhì)硅膠，加上高密度鍵合和雙封尾，使pH耐受范同zui大提高到lO。
注射用頭孢拉定流動(dòng)村1pH值為8，對(duì)色譜柱傷害很大，需要選擇pH值耐受性高的色譜柱。
6、峰形異常
峰形對(duì)稱性的優(yōu)劣對(duì)峰面積和分離度有很大的影響，從而影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。先檢查樣品足否過(guò)載，由于樣品過(guò)載引起的峰形后拖不能通過(guò)改變色譜條件消除。
如果發(fā)現(xiàn)過(guò)載，需降低進(jìn)樣量(包括進(jìn)樣體積或濃度)，進(jìn)樣量越小，峰形越好，例子如頭孢尼西鈉的測(cè)定。其次，硅醇基次級(jí)保留引起部分峰拖尾。
這種情況發(fā)生，選擇高密鍵合和徹底的雙蜂尾工藝的色譜柱能改善峰形。另外，溶解樣品的溶劑洗脫能力比流動(dòng)相強(qiáng)會(huì)發(fā)生峰前延，所以樣品zui好選用流動(dòng)相溶解。
7、色譜柱保存
短期保存(隔夜或隔周末)用所用的流動(dòng)相(不含緩沖鹽)保存為佳，以盡量減少下次使用的平衡時(shí)間。
一般只建議在長(zhǎng)期保存反相柱的時(shí)候用純醇或乙腈，使用80％左右有機(jī)相保存也屬好的選擇，且足以避免長(zhǎng)菌。
強(qiáng)烈建議在柱身上貼標(biāo)簽標(biāo)明保存溶劑。離子交換柱和水性凝膠柱等適合保存在水溶液中的色譜柱，可加0．05％化鈉溶液防止K菌。正相柱無(wú)論是短期還足長(zhǎng)期，都推薦保存住所用流動(dòng)相巾。
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